4、體外抗氧化活性試驗(yàn)

（1）對(duì)DPPH的清除能力

①DPPH溶液的配制自由基

精密稱取19.716mgDPPH，用無水乙醇溶解定容于250mL容量瓶中，得C=0.2mmol／L的溶液，于40℃冰箱避光保存。

②樣品溶液的制備

分別稱取干燥的黑果腺肋花楸提取物干浸膏、矢車菊素、氯化矢車菊素、VC適量，溶解并且配制成不同質(zhì)量濃度的樣品溶液。分別取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2mL于10mL比色管中，按參考文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行操作，在517am處測(cè)定吸光度A_空白，A_樣品，A_對(duì)照。按照公式計(jì)算黑果腺肋花楸提取物、矢車菊素、氯化矢車菊素、VC對(duì)DPPH自由基的清除率。

DPPH自由基清除率／％=(A_空白一A_樣品+A_對(duì)照)／A_空白×100

式中，A_空白-蒸餾水代替供試品溶液與DPPH溶液反應(yīng)后的吸光度值；A_樣品-各供試品溶液與DPPH溶液反應(yīng)后的吸光度值；A_對(duì)照-各供試品溶液與無水乙醇反應(yīng)后的吸光度值。

（2）FRAP法測(cè)定總的抗氧化能力

①FRAP工作液的配制

分別配制0.2mol／L醋酸鈉緩沖液(pH=3.6)，10mmol／LTPl億溶液(溶于40mmol／L鹽酸)，20mmol／LFeCl₃溶液。將上述三者按體積比10:1:1混合。

②FeSO₄標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確稱取0.01419FeSO₄，溶解并定容至50mL容量瓶中，即得濃度為lmmol／LFeSO₄溶液。吸取該溶液適量，配制成質(zhì)量濃度為2.82、8.46、14.10、19.74、25.38、28.20、33.84μg／mL的溶液。取各溶液加入3mLFRAP工作液，混勻后于37℃反應(yīng)10min，于593nm處測(cè)定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制定還原力標(biāo)準(zhǔn)曲線，列出擬合方程。

③被測(cè)物總抗氧化活性測(cè)定

分別稱取干燥的黑果腺肋花楸提取物干浸膏、矢車菊素、氯化矢車菊素、VC適量，溶解并且配制成不同質(zhì)量濃度的樣品溶液。分別取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液3mL于10mL比色管中，按參考文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行操作，在593nm處測(cè)定吸光度值。

(3)鉬酸銨法測(cè)定總的抗氧化能力

①鉬酸銨反應(yīng)體系的配制分別稱取

2.13g磷酸鈉、0.99g鉬酸銨、6.67mL硫酸溶于200mL水中，混勻。

②VC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確稱取0.02599VC，用蒸餾水溶解并定容至50mL容量瓶中，即得濃度為0.5mg／mL維生素C溶液。吸取該溶液適量，配制成質(zhì)量濃度為25、50、75、100、200、250tg／mL的溶液。吸取O.5mL不同濃度的溶液，加入到5mL鉬酸銨反應(yīng)體系中，反應(yīng)試管于95℃水浴90min。反應(yīng)液充分冷卻至室溫后，于695am處測(cè)定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制定VC抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)曲線，列出擬合方程。

③被測(cè)物總抗氧化活性測(cè)定分別稱取干

燥的黑果腺肋花楸提取物干浸膏、矢車菊素、氯化矢車菊素適量，溶解并且配制成不同質(zhì)量濃度的樣品溶液。分別取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液0.5mL加入到5mL鉬酸銨反應(yīng)體系中，按參考文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行操作，在695nm處測(cè)定吸光度值。被測(cè)物的總抗氧化能力以相當(dāng)于多少濃度的VC來表示。

二、結(jié)果與分析

（1）色譜條件的選擇

色譜柱為大連依利特ODS₂C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.2％磷酸水溶液(W)，程序?yàn)?～30min，40％A；流速：0.8mL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為276nm。氯化矢車菊素的保留時(shí)間為24.21min，理論塔板數(shù)為21917，與相鄰峰的分離度為2.28。HPLC色譜圖見圖1。

2、流動(dòng)相條件的選擇

試驗(yàn)結(jié)果表明適宜的流動(dòng)相為甲醇-O.2％磷酸水溶液(V:V=40:60)，能夠?qū)⒑诠倮呋ㄩ碧崛∥镏械穆然杠嚲账嘏c其他物質(zhì)分開，保留時(shí)間適中，按照氯化矢車菊素峰值計(jì)算理論塔板數(shù)為21917，與相鄰峰的分離度為2.28，故選擇在上述流動(dòng)相條件下進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。

3、供試品溶液制備方法的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

（1）正交試驗(yàn)結(jié)果

稱取黑果腺肋花楸提取物9份，每份0.5g，放入圓底燒瓶中，按正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

正交試驗(yàn)結(jié)果表明：供試品溶液制備方法的最優(yōu)方案為A₃B₃C₂，各因素的影響大小為：水解時(shí)間＞水解溫度＞溶劑酸濃度，確定供試品溶液制備方法的最優(yōu)方案為：水解溫度為100℃、水解時(shí)間為120min、酸濃度為3％鹽酸甲醇水溶液。

（2）工藝穩(wěn)定性驗(yàn)證試驗(yàn)

三次試驗(yàn)結(jié)果氯化矢車菊素的峰面積分別為1379.85、1382.57、1380.43，平均值為1380.95，其氯化矢車菊素含量分別為1.8660、1.8527、1.8523mg／g，平均值為1.8570mg／g，RSD為0.78％，結(jié)果表明，優(yōu)選的供試品溶液制備方法工藝比較穩(wěn)定。

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