目的研究蓽茇PiperlongumL.根的化學(xué)成分及其抗腫瘤活性。方法蓽茇干燥根莖95%乙醇提取物采用硅膠、SephadexLH-20、重結(jié)晶進(jìn)行分離純化，根據(jù)理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)鑒定所得化合物的結(jié)構(gòu)。MTT法測(cè)定其中2種典型生物堿的抗腫瘤活性。結(jié)果從中分離得到10個(gè)化合物，分別鑒定為β-谷甾醇(1)、胡蘿卜苷(2)、二十四烷酸(3)、十九烷酸(4)、蓽茇酰胺(5)、胡椒堿(6)、胡椒內(nèi)酰胺A(7)、胡椒內(nèi)酰胺D(8)、N-異丁基-(2E,4E,12Z)-十八烷基-1-酰胺(9)、3,4-亞甲二氧基肉桂酸(10)。化合物5對(duì)3株腫瘤細(xì)胞的IC50值均小于20μmol/L。結(jié)論化合物3～4、7～10為首次從該植物中分離得到，化合物5對(duì)3株腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒活性。

蓽茇PiperlongumL.為胡椒科胡椒屬藥用植物,主要產(chǎn)于菲律賓、印尼，在我國(guó)云南有野生，具有溫中散寒、下氣止痛的功效，臨床用于治療胃腹冷痛、食欲不振、消化不良、腎寒、嘔吐等癥，蒙醫(yī)、中醫(yī)都用其果實(shí)入藥，其溫?zé)嶂钥芍委熤薪刮负劝Y。維醫(yī)不同于蒙、藏、中醫(yī)，不是用蓽茇果實(shí)，而是用其根莖，作為消化系統(tǒng)的常用藥材。

國(guó)內(nèi)對(duì)蓽茇的研究主要集中在果實(shí)化學(xué)成分、胡椒堿提取工藝及含量測(cè)定等方面，而對(duì)蓽茇根化學(xué)成分的報(bào)道較少。因此，本研究對(duì)蓽茇根進(jìn)行化學(xué)成分分離及鑒定，從中得到10個(gè)化合物，其中3～4、7～10為首次從該植物中分離得到，5表現(xiàn)出較突出的抗腫瘤活性。

1材料

B260旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；XT5顯微熔點(diǎn)測(cè)試儀(溫度計(jì)未校正，北京市科儀電光儀器廠)；核磁共振光譜用AvanceⅢ-400MHz核磁共振儀測(cè)定(TMS內(nèi)標(biāo),瑞士Bruker公司)；ESI-MS譜用ImpactHDQ-TOF型質(zhì)譜儀測(cè)定(瑞士Bruker公司)；柱層析硅膠(200～300目)、薄層層析硅膠G(青島海洋化工有限公司)；SephadexLH-20(上海浩然生物技術(shù)有限公司)。石油醚、乙酸乙酯、甲醇等試劑均為分析純。蓽茇根采自云南山區(qū)，經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院康永祥教授鑒定為胡椒科胡椒屬植物蓽茇PiperlongumL.的根,陰干后粉碎備用。

2提取與分離

蓽茇根在室溫下陰干稱定質(zhì)量，約4.5kg，粉碎，加入95%乙醇，靜置24h回流提取，重復(fù)3次，提取液過濾合并，減壓濃縮得到浸提物約470g。蓽茇根的浸提物用硅膠拌樣，通過硅膠柱色譜用石油醚、乙酸乙酯、甲醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫，最終得石油醚部位24g、乙酸乙酯部位203g、甲醇部位232g。乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯及乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，得到9個(gè)組分Fr.A1～A9，反復(fù)硅膠柱層析、SephadexLH-20凝膠柱分離，經(jīng)薄層色譜檢識(shí)、多次重結(jié)晶后，從Fr.A2得到化合物1(465.8mg)、9(48.8mg)，從Fr.A3得到化合物5(12mg)、6(8.59g)、8(20mg)、10(30mg)，從Fr.A4得到化合物7(70.4mg)，從Fr.A5得到化合物2(3.22g)。石油醚部位經(jīng)硅膠柱層析，油醚-乙酸乙酯及乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，得到9個(gè)組分Fr.B1～B9，從Fr.B2得到化合物3(2.16g)，從Fr.B6得到化合物4(30mg)。

3結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:無色針狀結(jié)晶(石油醚),mp135～137℃。ESI-MSm/z:413[M-H]-,分子式C29H50O。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.36(1H,m,H-6),3.53(1H,m,H-3),0.69(3H,d,H-18),1.03(3H,s,H-19),0.93(3H,d,J=6.5Hz,H-21),0.86~0.78(9H,m,H-26,H-27,H-29)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:36.5(C-1),31.6(C-2),71.8(C-3),42.2(C-4),140.7(C-5),121.7(C-6),31.8(C-7),31.4(C-8),49.6(C-9),36.1(C-10),21.0(C-11),39.7(C-12),40.5(C-13),56.0(C-14),23.8(C-15),28.2(C-16),56.0(C-17),11.8(C-18),18.7(C-19),35.6(C-20),18.7(C-21),33.9(C-22),25.9(C-23),45.7(C-24),28.2(C-25),19.3(C-26),18.7(C-27),22.5(C-28),11.3(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致,故鑒定為β-谷甾醇。

化合物2:白色粉末,ESI-MSm/z:575[M-H]-,分子式C35H60O6,mp296～298℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:5.34(1H,m,H-6),4.90(1H,H-1′),4.44(2H,t,J=11.48Hz,H-6′),4.22(1H,d,J=7.72Hz,H-4′),3.64(1H,m,H-3),0.99(3H,H-21),0.96(3H,H-19),0.91(3H,d,J=6.32Hz,H-26),0.84(3H,H-29),0.80(3H,H-27),0.66(3H,s,H-18)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:140.3(C-5),121.1(C-6),100.7(C-1′),76.8(C-3),76.8(C-3′),76.7(C-5′),73.4(C-2′),70.0(C-4′),61.0(C-6′),56.1(C-14),55.3(C-17),49.5(C-9),45.0(C-24),41.8(C-13),40.2(C-12),38.2(C-4),36.7(C-20),36.1(C-1),35.4(C-10),33.3(C-22),31.3(C-7),31.3(C-8),29.2(C-2),28.6(C-25),27.7(C-16),25.3(C-23),23.8(C-15),22.5(C-28),20.5(C-11),19.7(C-26),19.0(C-19),18.8(C-21),18.5(C-27),11.7(C-18),11.6(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致,故鑒定為胡蘿卜苷。

化合物3:白色粉末(石油醚),ESI-MSm/z:367[M-H]-,mp52～54℃。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.89(3H,t,-CH3),1.27(40H,m),1.64(2H,m,-CH2),2.36(2H,t)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:179.7(C-1),33.5(C-2),26.3(C-3),23.1(C-23),13.6(C-24)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致,故鑒定為二十四烷酸。

化合物4:白色粉末(石油醚),ESI-MSm/z:297[M-H]-。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.88(3H,t,-CH3),1.27(30H,m,H-4～13),1.64(2H,m,-CH2),2.37(2H,t)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:180.4(C-1),34.5(C-2),27.7(C-3),22.2(C-18),13.1(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致,故鑒定為十九烷酸。

化合物5:白色晶體(甲醇),ESI-MSm/z:316[M-H]-。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:6.04(1H,m,H-3),6.95(1H,m,H-4),2.48(2H,m,H-5′),4.03(2H,m,H-6),6.80(1H,s,H-2′,6′),7.66(1H,d,H-7′),7.69(1H,d,H-8′),3.90(3H,s,OCH3-3′,OCH3-5′),3.85(3H,OCH3-4′)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:166.3(C-2),126.3(C-3),145.9(C-4),25.2(C-5),42.1(C-6),131.1(C-1′),106.0(C-2′,C-6′),153.8(C-3′,C-5′),140.3(C-4′),144.3(C-7′),121.5(C-8′),169.3(C-9′),56.6(OCH3-3′,OCH3-5′),61.4(OCH3-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)]一致,故鑒定為蓽茇酰胺。

化合物6:無色方晶(甲醇),mp135～136℃。碘化鉍鉀反應(yīng)陽性。ESI-MSm/z:284[M-H]-。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:6.44(1H,d,J=14.6Hz,H-2),7.40(1H,m,H-3),6.77(1H,m,H-4),6.74(1H,m,H-5),6.97(1H,d,J=1.4Hz,H-2′),6.77(1H,d,J=80Hz,H-5′),6.88(1H,dd,J=8.0,1.4Hz,H-6′),5.96(2H,s,-O-CN2-O-),3.55(2H,brs,H-1″),1.61(2H,m,H-2″),1.61(2H,m,H-3″),1.60(2H,m,H-4″),3.46(2H,brs,H-5″)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:165.3(C-1),120.0(C-2),142.4(C-3),125.3(C-4),138.1(C-5),130.9(C-1′),105.6(C-2′),148.1(C-3′),148.0(C-4′),108.4(C-5′),122.5(C-6′),101.3(-0-CH2-O),43.2(C-1″),26.7(C-2″),24.6(C-3″),25.6(C-4″),46.9(C-5″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致,故鑒定為胡椒堿。

化合物7:黃色粉末,ESI-MSm/z:264[M-H]-。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.65(1H,brs,-NH),9.27(1H,m,H-5),7.94(1H,m,H-8),7.77(1H,s,H-2),7.53(2H,m,H-6,7),7.13(1H,s,H-9),4.05(3H,s,4-OCH3)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:57.7(3-OCH3),104.8(C-9),109.0(C-2),114.9(C-4a),116.2(C-1),124.8(C-11),125.4(C-7),127.3(C-6),127.2(C-8a),127.9(C-5),129.2(C-8),134.6(C-5a),135.6(C-10),148.8(C-4),150.1(C-3),169.4(C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致,故鑒定為胡椒內(nèi)酰胺A。

化合物8:黃色粉末,ESI-MSm/z:294[M-H]-。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:3.93(3H,s,C3-OCH3),4.45(3H,s,C4-OCH3),7.26(1H,s,H-9),7.49(2H,m,H-6,H-7),7.88(1H,m,H-8),9.28(1H,m,H-5),9.82(1H,brs,NH)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:61.8(C3-OCH3),62.9(C4-OCH3),105.8(C-9),106.3(C-1),112.2(C-10a),125.6(C-7),126.7(C-6),127.2(C-4a),127.6(C-5a),127.8(C-5),129.2(C-8),134.2(C-9a),135.5(C-10),140.0(C-3),153.7(C-4),154.6(C-2),167.5(-C=O)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致,故鑒定為胡椒內(nèi)酰胺D。

化合物9:油狀物。ESI-MSm/z:332[M-H]-,分子式C22H39NO。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.53(1H,br,-NH),5.69(1H,d,J=14.8Hz,H-2),7.18(1H,dd,J=10Hz,H-3),6.11(1H,m,H-4),6.07(1H,m,H-5),2.17(2H,m,H-6),1.25～1.41(14H,m,H-7,8,9,10,15,16,17),2.01(2H,m,H-11),5.35(1H,m,H-12),5.34(1H,m,H-13),2.01(2H,m,H-14),0.89(3H,m,H-18),3.16(2H,t,J=6.4Hz,H-2′),1.68(1H,m,H-3′),0.92(6H,m,H-4,5′)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:166.4(C-1),121.7(C-2),143.2(C-3),128.3(C-4),141.3(C-5),33.0(C-6),28.9(C-7),29.4(C-8),29.6(C-9),29.3(C-10),26.1(C-11),129.5(C-12),129.6(C-13),27.3(C-14),29.4(C-15),32.0(C-16),22.7(C-17),14.1(C-18),46.9(C-2′),28.6(C-3′),20.5(C-4′,5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致,故鑒定為N-異丁基-(2E,4E,12Z)-十八烷基-1-酰胺。

化合物10:黃色粉末,ESI-MSm/z:191[M-H]-,分子式C10H8O4。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.59(1H,d,J=15.9Hz,3-H),6.96～6.76(3H,d,Ar-H),6.34(1H,d,J=15.9Hz,2-H),5.90(2H,s,-O-CH2-O-)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:179.7(C-1),33.5(C-2),31.4(C-3),29.2(C-4),29.2(C-5),29.1(C-6),29.1(C-7),28.9(C-8),28.8(C-9),28.5(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致,故鑒定為3,4-亞甲二氧基肉桂酸。

4抗腫瘤活性

選取3種常見的腫瘤細(xì)胞株，對(duì)化合物5、6進(jìn)行抗腫瘤活性測(cè)試。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人前列腺腫瘤細(xì)胞株P(guān)C3、人肺癌腫瘤細(xì)胞株A549、人乳腺癌腫瘤細(xì)胞株MCF7，加入適量0.25%的胰蛋白酶消化后，用DMEM培養(yǎng)液配成1×105/mL細(xì)胞懸液，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100μL，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，吸去上清液，加入不同質(zhì)量濃度的化合物，別為200、67、22、7.4、2.5、0μmol/L,作為實(shí)驗(yàn)組；加入100μL5%DMEM培養(yǎng)液，作為空白組,每組3孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4h，每孔加入20μLMTT(5mg/mL，用PBS緩沖液配置)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清液,加入100μL/孔DMSO,振蕩混勻后,在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值,計(jì)算抑制率,公式為抑制率=[(1-平均OD值實(shí)驗(yàn)組/平均OD值對(duì)照組)]×100%。

以阿霉素(DOX)作為陽性對(duì)照，化合物5～6對(duì)3株腫瘤細(xì)胞(PC3、A549、MCF7)的細(xì)胞毒性見圖1。結(jié)果表明,化合物5對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，而化合物6作用較弱。

5討論與結(jié)論

胡椒屬為胡椒科中最大的屬。國(guó)內(nèi)外對(duì)該屬植物的化學(xué)成分和藥理作用作了大量的研究，發(fā)現(xiàn)其中含有生物堿、黃酮、木脂素、揮發(fā)油及脂肪酸類等多種成分。本研究從蓽茇根中分離鑒定了10個(gè)化合物，化合物3～4、7～10為首次從蓽茇根中分離得到，其中甾體類1個(gè)、糖苷類1個(gè)、有機(jī)酸類3個(gè)、生物堿類5個(gè)。近年來研究表明酰胺類生物堿是胡椒屬植物的主要生物堿成分。本研究發(fā)現(xiàn)胡椒堿為蓽茇根中的主要成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為桂皮酰胺類。研究證明此類化合物具有消炎止痛、抗驚厥、鎮(zhèn)靜、抗抑郁等作用。通過抗腫瘤活性測(cè)試，表明蓽茇酰胺有顯著的抗腫瘤活性，可彌補(bǔ)蓽茇根化學(xué)成分研究的不足，有利于將其開發(fā)成抗癌的天然藥物或保健產(chǎn)品。

聲明:本文所用圖片、文字來源《中成藥》2021年第1期，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請(qǐng)與本網(wǎng)聯(lián)系

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