癌癥常規(guī)治療策略主要有手術(shù)、化療和放療，但是療效局限性、藥物毒副作用及耐藥性等仍是治療過程中面臨的巨大挑戰(zhàn)，目前癌癥仍然是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一。近年來，納米技術(shù)在提高癌癥藥物療效方面顯示出前所未有的優(yōu)勢。其中，二硫化鉬作為一種新型的二維材料備受人們的關(guān)注。二硫化鉬不僅具有較大的比表面積，而且其組成元素Mo是細(xì)胞中幾種酶的必需微量元素，S是一種常見的生物元素。因此，MoS2在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用具有巨大的潛力。阿霉素（DOX）具有抗瘤譜廣，療效強(qiáng)的特點(diǎn)。但是，由于DOX在使用時(shí)會引起嚴(yán)重的毒副作用，長期使用還會導(dǎo)致耐藥性。

因此，可在特定區(qū)域?qū)崿F(xiàn)定點(diǎn)釋放藥物的智能納米復(fù)合物逐漸引起研究者們的興趣，如開發(fā)可刺激響應(yīng)的藥物載體。目前，環(huán)境刺激響應(yīng)的納米載藥體系在腫瘤病理環(huán)境刺激，如溫度、酶、酸度和氧化還原條件，響應(yīng)納米載藥體系可在病灶部位有效釋放其加載的治療藥物。腫瘤細(xì)胞中谷胱甘肽的濃度在1～10mmol/L之間，比細(xì)胞外循環(huán)和體液中谷胱甘肽的濃度（2～10mol/L）高出500～1000倍。利用這一區(qū)別，設(shè)計(jì)二硫鍵連接DOX的納米載藥體系逐漸被應(yīng)用于生物醫(yī)藥的研究，該共價(jià)載藥方法與通過靜電吸附DOX的載藥方法相比，前者可減少藥物在運(yùn)輸過程中的泄露。

為了提高DOX在腫瘤部位的聚集實(shí)現(xiàn)高效殺死腫瘤細(xì)胞的目的。
RGD是一種靶向分子，可特異性識別琢淄茁3整合素受體，因此，增加靶向分子為納米載藥體系提供了指引的作用，使納米載藥體系與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合從而提高治療效果。本文設(shè)計(jì)了一種靶向MoS2納米載藥體系，以MoS2納米片為基底，硫辛酸聚乙二醇羧酸（LA-PEG-COOH）為接枝連接靶向分子RGD，之后連接上SPDP，得到MoS2-PEG-RGDSPDP（MPRS）納米載體。最終通過共價(jià)鍵合DOX得到MPRS-DOX納米載藥體系，并研究其載藥量及釋藥性能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

鉬酸銨·四水、硫脲、硫辛酸-聚乙二醇-羧酸（LA-PEG-COOH）（相對分子質(zhì)量為5000）、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）、3-（2-吡啶二硫代）丙酸N-琥珀酰亞胺酯（SPDP）、鹽酸阿霉素、谷胱甘肽（還原型），購自阿拉丁試劑上海有限公司。EDTA，購自索萊寶生物科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

十萬分之一電子分析天平，美國梅特勒-多利多儀器（上海）有限公司；超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；超純水機(jī)，成都越純科技有限公司；透射電子顯微鏡（TEM），日本電子株式會社；X-射線光電子能譜，賽默飛世爾科技有限公司；ZetasizerNanoZS納米粒度電位儀，英國馬爾文儀器有限公司；紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司；熒光分光光度計(jì)，美國安捷倫公司；高速離心機(jī)，上海湘儀離心機(jī)儀器有限公司；磁力攪拌器，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；冷凍干燥機(jī),北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MoS2的制備MoS2納米片的制備參考文獻(xiàn)中的制備方法，將2.336g鉬酸銨·四水和5.057g硫脲溶解在70mL的去離子水中，并用超聲助溶形成均相溶液。將得到的均相溶液置于100mL內(nèi)襯為聚四氟乙烯的不銹鋼反應(yīng)釜中，在200℃烘箱中反應(yīng)10h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，在12500r/min下離心20min，棄去上清液，重復(fù)清洗4次，最后用去離子水分散，超聲處理8h，4500r/min離心10min后，取上清液，除去底部大尺寸的二硫化鉬，將得到的上清液用透析袋（8000~14000Da）除雜，即可得到二硫化鉬納米片分散液。

1.2.2 MoS2-PEG（簡稱MP）的制備參考文獻(xiàn)[31]的方法：稱取50mgLA-PEG-COOH粉末加入0.25mg/mL20mL的MoS2分散液中，超聲處理30min，攪拌24h后，透析雜質(zhì)，得到的MP分散液。

1.2.3 MoS2-PEG-RGD（簡稱MPR）的制備參考文獻(xiàn)的制備方法，稱取96mgEDC加入17.5mL1.60mg/mL的MP分散液，避光攪拌20min，加入80.5mgNHS，避光攪拌1h，之后加入400滋L12.5mg/mLRGD溶液，避光攪拌24h，停止攪拌后以12500r/min離心10min，重復(fù)清洗3次，透析除雜，得到MPR分散液。將部分分散液冷凍干燥得到固體的MPR儲存?zhèn)溆茫溆嗟腗PR密封放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 MoS2-PEG-RGD-SPDP（簡稱MPRS）的制備參考文獻(xiàn)的制備方法，稱取2.20mg3-（2-吡啶二硫代）丙酸N-琥珀酰亞胺酯（SPDP）加入到35mL0.43mg/mLMPR分散液中，緩慢攪拌4h后，透析除雜，得到MPRS分散液。將部分分散液冷凍干燥得到固體的MPRS儲存?zhèn)溆茫溆嗟腗PRS分散液密封放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 MoS2-PEG-RGD-SPDP-DOX（簡稱MPRS-DOX）的制備稱取9.00mgDOX和2.16mg亞氨基噻吩于10mL離心管中，加入1mL去離子水溶解DOX，并用0.01mol/LPBS（pH=7.4磷酸緩沖對，含1mmol/LEDTA）稀釋至9mL，避光靜置反應(yīng)4h。將以上制備得到的9mLDOX-SH溶液與18.0mL0.5mg/mLMPRS分散液混合，然后將混合分散液避光攪拌24h，之后以12500r/min離心45min，沉淀物用10mmol/LPBS（pH=7.4,磷酸緩沖對溶液）分散，即可得到MPRS-DOX分散液。將部分分散液冷凍干燥得到固體的MPRS-DOX儲存?zhèn)溆?，剩余的MPRS-DOX分散液密封放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 MPRS的載藥研究稱取10.00mg鹽酸阿霉素置于10.00mL容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，超聲處理至阿霉素完全溶解，得到1mg/mL阿霉素儲備液，將其依次配制成濃度為5、10、15、20、25、30、35、40滋g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別使用紫外-可見分光光度計(jì)測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液在480nm波長處的吸光度值，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線。

為了驗(yàn)證DOX是通過共價(jià)連接MPRS，采用紫外-可見分光光度計(jì)檢測MPRS、DOX、MPRS-DOX在800～200nm波長范圍內(nèi)的紫外-可見光譜。取適量MPRS分散液、DOX溶液、MPRS-DOX分散液稀釋至一定的濃度，然后利用紫外-可見分光光度計(jì)檢測。將MPRS與不同濃度（0.1,0.2,0.4,0.8,1mg/mL）的巰基化阿霉素溶液混合，在37℃避光振蕩24h，以12500r/min離心45min，收集上清液，通過紫外分光光度計(jì)測試其載藥能力。根據(jù)公式（1）和（2）推算出MPRS-DOX的載藥量以及載藥效率。

1.2.7 MPRS-DOX的體外釋藥將質(zhì)量比為1:1的MPRS分散液和DOX混合，攪拌24h，離心收集沉淀，再用去離子水分散MPRS-DOX濃度至1mg/mL。采用熒光分光光度計(jì)檢測MPRS-DOX對GSH響應(yīng)釋放DOX的情況。取200LMPRS-DOX分散液和200L不同濃度（0，2滋mol/L，10mmol/L）GSH加入到2mLEP管中，并用10mmol/LPBS（pH=7.4和pH=5.5磷酸緩沖對）稀釋至1mL，避光恒溫（37℃）振蕩4h，然后以12500r/min離心20min，收集上清液和沉淀物，在Ex=488nm波長下掃描上清液中DOX的熒光光譜，掃描波長范圍為500~700nm。

1.2.8 材料表征使用TEM觀察制備的MoS2和MPRS的形貌。使用X-射線光電子能譜儀對MoS2、MP、MPR、MPRS進(jìn)行測試分析。使用納米粒度電位儀測試MoS2、MP、MPR、MPRS和MPRS-DOX的粒度分布和電位。采用紫外-可見分光光度計(jì)對MPRS的載藥情況進(jìn)行測試。采用熒光分光光度計(jì)測試MPRS-DOX釋放DOX的情況。

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