目的探討?zhàn)B心氏片治療冠心病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與潛在的作用機(jī)制。方法采用HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)養(yǎng)心氏片(Yangxinshitablet，YXST)的入血成分進(jìn)行分析；利用STITCH、TCMSP、BindingDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)YXST入血成分的靶點(diǎn)；采用TTD、DrugBank、PharmGKB、MalaCards、CTD數(shù)據(jù)庫收集冠心病相關(guān)靶點(diǎn)；通過STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)得到的成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白相互作用關(guān)系(protein-proteininteraction，PPI)網(wǎng)絡(luò)從而篩選YXST治療冠心病的潛在靶點(diǎn)；利用R軟件的clusterProfiler包對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論(geneontology，GO)功能注釋和京都基因和基因組百科全書(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG)通路分析；采用Cytoscape軟件構(gòu)建“入血成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并分析關(guān)鍵化合物和關(guān)鍵靶點(diǎn)。

結(jié)果通過對(duì)大鼠口服灌胃給予YXST提取液后的血漿進(jìn)行分析，共檢測(cè)到26個(gè)原型成分。在數(shù)據(jù)庫中收集得到入血成分對(duì)應(yīng)的287個(gè)靶點(diǎn)和冠心病相關(guān)的199個(gè)靶點(diǎn)。通過交集分析和PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建共獲得70個(gè)YXST治療冠心病的潛在靶點(diǎn)。對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，YXST治療冠心病主要涉及了炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(advancedglycationendproducts-receptorforadvancedglycationendproducts，AGE-RAGE)、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子(tumournecrosisfactor，TNF)、白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、C型凝集素受體、Th17細(xì)胞分化、Toll樣受體等信號(hào)通路。通過構(gòu)建“入血成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析得到3個(gè)關(guān)鍵化合物和16個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。結(jié)論YXST可通過調(diào)節(jié)TNF、PTGS2、NOS2、NOS3等關(guān)鍵靶點(diǎn)干預(yù)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、動(dòng)脈粥樣硬化等過程發(fā)揮治療冠心病的作用，其潛在的有效成分為大豆苷、小檗堿和葛根素。本研究充分體現(xiàn)了YXST通過多成分-多靶點(diǎn)-多途徑治療冠心病的作用特點(diǎn)，為深入研究YXST的藥理作用機(jī)制提供重要參考。

冠心病是臨床上常見的一種心血管疾病，主要發(fā)生于中老年人群。近年來，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的變化，該病的發(fā)病率和死亡率逐年上升，并呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類健康。冠心病主要是由冠狀動(dòng)脈結(jié)構(gòu)或功能異常，使血管狹窄、痙攣或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟疾病。中醫(yī)理論認(rèn)為，冠心病屬“胸痹”“心痛”范疇，因痰濁阻滯，瘀血?dú)鉁?，累及于心，?dǎo)致心脈不暢，血脈痹阻，故治療原則上應(yīng)以活血化瘀為法。

養(yǎng)心氏片(Yangxinshitablet，YXST)是由黃芪、黨參、丹參、葛根、淫羊藿、山楂、地黃、當(dāng)歸、黃連、延胡索、靈芝、人參和甘草共13味藥材制成的一種中藥復(fù)方制劑，具有益氣活血、化瘀止痛之功效，在臨床上常用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞等心血管疾病?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，YXST具有抗血小板聚集、降低血黏度、抑制血栓形成、降低心肌耗氧量、改善心肌缺血，增強(qiáng)心功能等作用。目前，對(duì)YXST的研究多集中于臨床或是在動(dòng)物模型上對(duì)某些因子的考察，缺乏對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的深入研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)等理論，通過對(duì)“藥物-靶點(diǎn)-疾病”之間復(fù)雜互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的分析，多層次地闡明藥物治療疾病的作用機(jī)理。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有整體、系統(tǒng)的分析特點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于中藥領(lǐng)域各方面的研究。此外，血清藥物化學(xué)認(rèn)為，給藥后血液中含有的成分才是中藥復(fù)方在體內(nèi)直接發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)。因此，本研究首先采用HPLC-ESIQ-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)YXST的入血成分進(jìn)行分析。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析YXST入血成分的作用靶點(diǎn)，探討YXST治療冠心病可能的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

超高效液相色譜儀，配置在線脫氣機(jī)、四元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器和紫外檢測(cè)器均購自美國(guó)Waters科技有限公司；TripleTOF5600plus質(zhì)譜儀(美國(guó)ABSCIEX公司)；XS105DU十萬分之一電子天平(瑞士MettlerToledo公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；H1650-W型高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

YXST(規(guī)格：0.6g×36片/盒；批號(hào)：151102)由青島國(guó)風(fēng)藥業(yè)股份有限公司提供。木蘭花堿(批號(hào)：MUST-15110910)、葛根素(批號(hào)：MUST-13111203)、甘草苷(批號(hào)：MUST-16032801)、黃連堿(批號(hào)：MUST-15011004)、表小檗堿(批號(hào)：MUST-15022101)、大豆苷(批號(hào)：MUST-12102710)、非洲防己堿(批號(hào)：MUST-13101201)、鹽酸藥根堿(批號(hào)：MUST-15112011)、鹽酸小檗堿(批號(hào)：MUST-12122110)、巴馬汀(批號(hào)：MUST-12022707)、脫氫紫堇堿(批號(hào)：MUST-12051002)、丹酚酸B(批號(hào)：MUST-13103113)和靈芝酸A(批號(hào)：MUST-16051010)對(duì)照品均購自成都曼斯特生物科技有限公司，純度均>98%。甲醇(色譜純，批號(hào)：20141016)購自百靈威科技有限公司；甲酸(色譜純，批號(hào)：k1612047)購自阿拉丁試劑有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2動(dòng)物

6只SD大鼠，♂，體質(zhì)量(200±20)g，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(浙)2012-0178。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食飲水，保持12h光照/黑暗，溫度為(20±2)℃，相對(duì)濕度控制在(50±10)%。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作遵守浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物道德倫理委員會(huì)有關(guān)規(guī)定。

1.3樣品制備

1.3.1YXST提取液的制備

取YXST，除去包衣，研細(xì)。稱取20g粉末，用500mL70%甲醇超聲處理60min，抽濾，將提取液濃縮至每1mL含生藥粉末1g。

1.3.2大鼠血漿樣品的制備

大鼠受試前12h禁食不禁水，口服灌胃給予YXST提取液14g·kg–1。給藥前和給藥后1h從尾靜脈取血0.5mL，4000r.min-1離心5min，分離血漿，于–20℃下保存。分析前，取血漿樣品200μL，加入5倍量甲醇，渦旋30s后靜置10min，13000r.min-1離心10min。取上清液在常溫下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00μL70%甲醇復(fù)溶，13000r.min-1離心10min，取上清供HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS分析。

1.4色譜與質(zhì)譜條件

HPLC分離采用WatersUPLCsystem，色譜柱為WatersCORTECSC18+(4.6mm×150mm,2.7μm)。流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸甲醇溶液(B)，梯度洗脫：0~20min，5%→25%B；20~40min，25%→41%B；40~60min，41%→81%B；60~65min，81%→96%B；65~70min，96%B。分析時(shí)間70min，后運(yùn)行10min，進(jìn)樣量10μL，流速0.5mL·min–1，柱溫35℃。

質(zhì)譜分析采用TripleTOF5600plus質(zhì)譜儀，對(duì)ESI正(+)負(fù)(–)離子同時(shí)進(jìn)行掃描，參數(shù)設(shè)置如下：噴霧電壓：+5.5kV(+)和−4.5kV(–)；離子源溫度：600℃(+)和550℃(–)；Gas1：空氣，50psi；Gas2：空氣，50psi；CUR：氮?dú)猓?0psi；碰撞電壓：(40±20)V；掃描范圍：TOF-MS為m/z100~2000，TOF-MS/MS為m/z50~2000。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Peakview軟件(ABSCIEX,version1.2.0.3)進(jìn)行處理。

1.5網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.5.1YXST入血成分靶點(diǎn)的收集

基于上述鑒別得到的YXST入血成分，用化合物名稱或結(jié)構(gòu)式(SMILES格式表示)為；

關(guān)鍵詞在STITCH(SearchToolforInteractionsofChemicalsandProteinsDatabase,http://stitch.embl.de/)；

TCMSP(TraditionalChineseMedicineSystemsPharmacologyDatabaseandAnalysisPlatform,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；

BindingDB(https://www.bindingdb.org/bind/index.jsp)；

數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，得到每個(gè)入血成分的靶點(diǎn)。

再通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將靶點(diǎn)名歸整成標(biāo)準(zhǔn)基因名(Officialsymbol)，限定物種為“Homosapiens”。

1.5.2冠心病相關(guān)靶點(diǎn)的收集

以“coronaryheartdisease”“coronarydisease”為關(guān)鍵詞：

通過TTD(TherapeuticTargetDatabase,http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)；

DrugBank(https://www.drugbank.ca/)、PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/)；

MalaCards(https://www.malacards.org/)；

CTD(ComparativeToxicogenomicsDatabase,http://ctdbase.org/)

數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，獲取冠心病相關(guān)的靶點(diǎn)，并按“1.5.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5.3YXST治療冠心病潛在靶點(diǎn)的篩選

取入血成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集，即得YXST治療冠心病的直接作用靶點(diǎn)。此外，將成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用(protein-proteininteraction,PPI)分析，限定物種為“Homosapiens”，根據(jù)置信度分值選擇confidencescore≥0.7的數(shù)據(jù)，并使用Cytoscape軟件(version3.6.0)進(jìn)行可視化，進(jìn)一步篩選與疾病靶點(diǎn)存在間接作用關(guān)系的成分靶點(diǎn)。將直接和間接作用靶點(diǎn)合并即得YXST治療冠心病的潛在靶點(diǎn)。

1.5.4功能注釋及通路分析

基于上述所得的YXST治療冠心病的潛在靶點(diǎn)，利用R語言(version3.4.1)的clusterProfiler包進(jìn)行基因本體論(geneontology，GO)功能注釋和京都基因和基因組百科全書(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG)通路分析，探索YXST治療冠心病的分子作用機(jī)制。

1.5.5網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析

將得到的入血成分和對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建“入血成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，再利用NetworkAnalyzer插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)湫再|(zhì)分析，包括節(jié)點(diǎn)度(degree)、介數(shù)中心度(betweennesscentrality)和緊密中心度(closenesscentrality)。依據(jù)3項(xiàng)數(shù)值均在平均值以上的標(biāo)準(zhǔn)篩選YXST治療冠心病的關(guān)鍵化合物和關(guān)鍵靶點(diǎn)。

聲明：本文所用圖片、文字來源《中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)》2020年8月，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請(qǐng)與本網(wǎng)聯(lián)系
 

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