（4）綠豆多肽抗氧化性與酶解時間的關(guān)系

通過單因素實驗的結(jié)果，可以篩選出各因素的三個水平。所以在此基礎(chǔ)之上，應用統(tǒng)計分析軟件建立4因素3水平的Box—Behnken模型，進行回應面優(yōu)化設計實驗條件進行實驗，改變酶解時間結(jié)果見4所示。

由圖4可知，當反應時間不超過2h，DPPH清除率與溫度成正比，當反應時間超過2h，DPPH清除率與溫度成反比，在2h時DPPH清除率達到峰值。當水解的時間過短時，綠豆蛋白大分子沒有水解成具有小分子生物活性的生物活性肽，因而水解物DPPH的清除率較小。而水解的時間過長則會導致大分子蛋白質(zhì)過度水解成氨基酸或者是已不具備生物活性短肽鏈的物質(zhì)。

2、應面實驗結(jié)果

（1）回歸方程模型方差分析

單因素實驗討論了各個因素對綠豆多肽抗氧化性的影響，為了全面考察影響因素，仍需確定酶解時間、酶解溫度、pH、酶濃度對綠豆抗氧化肽的抗氧化性的影響。故采用繼續(xù)用響應法對綠豆抗氧化肽提取的工藝進行優(yōu)化。以酶解溫度(X₁)、酶解pH(X₂)、酶濃度(X₃)、酶解時間(X₄)為自變量，DPPH清除率的響應面實驗結(jié)果見表2。溫度(X₁)、酶解pH(X₂)與酶濃度(X₃)、酶解時間(X₄)為自變量，DPPH清除率為回應值的響應面實驗結(jié)果見表2。

根據(jù)響應面實驗設計及其實驗結(jié)果，需要建立回歸方程模型，用于判斷各因素之間的交互作用是否顯著，為用于研究和分析綠豆多肽抗氧化性的變化，故而還需判斷其誤差的大小。即實驗擬合度與在最佳條件下抗氧化性的吻合程度。綠豆多肽抗氧化性的回歸方程模型的方差分析如表3所示。

由表3可知，該回歸模型P＜O.000l，方程模型達到極顯著，失擬項P=0.1471＞0.05，不顯著，說明模型建立正確。該回歸模型的總決定系R²=0.9568，說明方程擬合度較好，實驗誤差小，故該回歸方程模型成立，可以用此模型對綠豆多肽的抗氧化性進行分析及預測。由此模型得到的此回歸方程為：Y=45.24—6.00X₁+1.47X₂—1.35X₃+0.36X₄+1.81X₁X₂—2.60X₁X₃+1.06X₁X₄+0.20X₂X₃一0.17X₂X₄+0.14X₃X₄—4.98X₁²—0.97X₂²—0.70X₃²—0.90X₄²。

（2）響應曲面結(jié)果分析

響應面圖可反映出各個因素對綠豆多肽抗氧化性的影響，根據(jù)曲面圖的開口朝向及曲面形狀判斷在實驗范圍內(nèi)是否存在最值、各因素之間的相互作用是否顯著。

結(jié)合表3、圖5及圖6可看出，影響DPPH自由基清除率的先后順序為：溫度(X₁)＞pH(X₂)＞酶濃度(X₃)>酶解時間(X₄)，X₁、X₂、X₃、X_1³項達到互極顯著水平(P＜0.01)，X_1²、項達到顯著水平(P＜0.05)。響應面的最優(yōu)條件：溫度43.47℃，pH為9.19，酶濃度為6.51％，水解時間為2.22h，DPPH自由基清除率47.14％。

3、驗證實驗

為了驗證響應面結(jié)果的可靠性，根據(jù)響應面優(yōu)化出的最佳工藝進行三次驗證實驗。實際得到的綠豆多肽DPPH清除率的平均值是47.03％，與分析值相差0.23％。與響應面預測值較為吻合，說明響應面得出的最優(yōu)條件具有可行性。

三、結(jié)論

通過響應面優(yōu)化實驗分析出影響綠豆抗氧化肽的制備因素，這四個因素對綠豆抗氧化肽提取的影響程度順序為：酶解溫度＞pH＞酶濃度＞酶解時間。本實驗得出的綠豆抗氧化工藝條件為：酶解溫度43.47℃、pH9.19、酶濃度6.51％、酶解時間2.22h，在此工藝條件下得到的綠豆抗氧化肽對DPPH清除率的平均值為47.03％，與軟件給出的理論值相差0.23％。本實驗對綠豆抗氧化肽提取條件進行了優(yōu)化，且綠豆多肽的抗氧化性為綠豆多肽在抗氧化食品、保健品等方面的開發(fā)及藥理學研究提供了更為有效的依據(jù)。

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