一、引言

夏枯草(學(xué)名為PrunellavulgarisLinn英文名為CommonSelJheal)，為唇形科夏枯草屬植物夏枯草的干燥果穗。夏枯草功能繁多，如降血壓、降血脂、抗菌、抗病毒、降糖、抗炎及免疫抑制、治療頭疼眩暈、抑制食管癌ECa109腫瘤細(xì)胞的增殖、調(diào)控Raji細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡、清除DPPH自由基和較強(qiáng)的抗氧化性。另外夏枯草作為一種藥食同源的中藥，其開(kāi)發(fā)價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景非常廣闊，但夏枯草在壽命方面的研究報(bào)道尚少。

草在壽命方面的研究報(bào)道尚少。本研究選用黑腹果蠅作為模式生物對(duì)夏枯草水提取物進(jìn)行抗衰老作用研究。將夏枯草水提取物進(jìn)行不同程度的稀釋，并分別添加到培養(yǎng)基中飼喂果蠅進(jìn)行壽命實(shí)驗(yàn)，在壽命實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)最高濃度的夏枯草水提物可以延長(zhǎng)雌性果蠅壽命，因而對(duì)最高濃度進(jìn)行了深入的研究，以一定時(shí)間內(nèi)雌性果蠅產(chǎn)卵數(shù)目來(lái)評(píng)價(jià)夏枯草水提物對(duì)果蠅生殖系統(tǒng)的影響，以每分鐘的活動(dòng)次數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)夏枯草水提物對(duì)果蠅睡眠的影響，以果蠅進(jìn)食量來(lái)評(píng)價(jià)夏枯草對(duì)果蠅熱量攝入的影響。為夏枯草在醫(yī)藥、保健品、飲料等相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用提供參考。

一、材料與方法

1、材料與儀器

夏枯草購(gòu)買自本草鋪，黑腹果蠅，美國(guó)BloomingtonDrosophilaStockCenter(BDSC)購(gòu)買所得，基因型為Canton-S。

對(duì)羥基苯甲酸乙酯、瓊脂粉、無(wú)水氯化鈣、葡萄糖，均購(gòu)買于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純AR；千島湖純凈水、白砂糖、玉米粉，以上均購(gòu)買自普通農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；安琪酵母粉，京東；無(wú)水乙醇、95％乙醇以及丙酸，購(gòu)買于杭州米克化工儀器有限公司；亮藍(lán)，阿拉丁(上海)。

智能人工氣候箱，寧波萊福科技有限公司；水熱合成反應(yīng)釜，西安常儀儀器設(shè)備有限公司內(nèi)膽為聚四氟乙烯；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)，上海精宏鼓風(fēng)干燥箱DHG-9426ASHZ-D(III)型循環(huán)水真空泵，邦西儀器科技(上海)有限責(zé)任公司；0.229m水系濾膜，生工生物工程(上海)股份有限公司；果蠅活動(dòng)監(jiān)測(cè)器，美國(guó)Trikinetics公司；手動(dòng)組織研磨器，生工生物工程(上海)股份有限公司l酶標(biāo)儀，ThermoFisher；離心機(jī)，ThermoFisher；透明水浴鍋，金壇實(shí)驗(yàn)儀器。

2、方法

（1）中藥成分的提取

采用水熱合成反應(yīng)釜高溫提取Illl，取夏枯草1.59加入60mL水，在lOOmL反應(yīng)釜中，放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)中，反應(yīng)條件為100℃，反應(yīng)時(shí)間為3h，后冷卻至室溫，用229m水系濾膜真空抽濾機(jī)過(guò)濾，得到夏枯草水提物40mL(下文使用夏枯草水提物代指此步驟得到的溶液)。

（2）果蠅培養(yǎng)基

高熱量(3.0X)培養(yǎng)基每升含瓊脂15g、酵母300g、白砂糖50g、氯化鈣0.7126g、對(duì)羥基苯甲酸乙酯9g溶于30mL的95％乙醇中、丙酸6mL，用來(lái)進(jìn)行壽命實(shí)驗(yàn)。

(3)壽命實(shí)驗(yàn)方法

收集24小時(shí)內(nèi)羽化的果蠅，進(jìn)行隨機(jī)分組并放置到新的果蠅管中，每管約為40只果蠅，使雌性果蠅與雄性果蠅隨機(jī)完成交配。48h后，對(duì)交配過(guò)的果蠅進(jìn)行區(qū)分雌雄，然后隨機(jī)分組，每管中40只果蠅。壽命實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)不同濃度：對(duì)照組(添加等量的蒸餾水100μL)、低濃度(1∶100稀釋的粗提取液1009L)、中間濃度(1∶10稀釋的粗提取液lOOgL)、高濃度(母液100μL)，每個(gè)性別3管。實(shí)驗(yàn)所用溫度為25℃(相對(duì)濕度為60％±5％，12h亮12h暗)。實(shí)驗(yàn)每隔一天(0、2、4、6、……)定時(shí)為果蠅更換培養(yǎng)基，并統(tǒng)計(jì)死亡果蠅的數(shù)目，記錄下每天果蠅的死亡數(shù)量。延壽率=[(實(shí)驗(yàn)組平均壽命一對(duì)照組平均壽命)］／對(duì)照組平均壽命×100％。

(4)進(jìn)食量測(cè)定實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)收集方法，收集10天齡的雌雄果蠅各120只，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各60只，每個(gè)濃度分成3管，每管20只果蠅。實(shí)驗(yàn)所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基與壽命實(shí)驗(yàn)相同，在食物表面添加200μL濃度10.8％的亮藍(lán)溶液、水1OOμL作為對(duì)照組，100μL夏枯草水提物作為實(shí)驗(yàn)組。將果蠅分別放入上述培養(yǎng)基中3h，之后零下18℃冷凍lh，加入1200μL去離子水，用手動(dòng)組織研磨器研磨碎，高速恒溫離心機(jī)9000r／min離心15min，取上清液200μL放入酶標(biāo)儀中629nm處測(cè)量吸光度。

（5）熱刺激

參考文獻(xiàn)方法，收集10天齡的雌果蠅80只，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各40只，每個(gè)濃度4管，每管10只。將果蠅放人干空的果蠅管中，放入39℃的透明水浴鍋中，每10min記錄一次果蠅的死亡數(shù)量(果蠅面朝上躺在果蠅管底部，且20s內(nèi)不再抽搐，則記錄為死亡)。

（6）產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)方法，收集10天齡的雌果蠅200只，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各100只，每個(gè)濃度5管，每管20只雌果蠅。實(shí)驗(yàn)所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基與壽命實(shí)驗(yàn)相同，在食物表面添加200μL濃度10．8％的亮藍(lán)溶液、水100μL作為對(duì)照組，lOOμL夏枯草作為實(shí)驗(yàn)組。將果蠅放在上述處理之后的食物上，并放到與壽命相同條件的培養(yǎng)箱中，22h之后，清除雌果蠅，顯微鏡下計(jì)數(shù)果蠅卵的個(gè)數(shù)。

（7）睡眠分析方法

參考文獻(xiàn)方法，收集10天齡的雌雄果蠅各80只，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各40只，每個(gè)濃度分成4管，每管10只果蠅。實(shí)驗(yàn)所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基與壽命實(shí)驗(yàn)相同，在食物表面添加水100I_tL作為對(duì)照組，lOOgL夏枯草作為實(shí)驗(yàn)組。放入Trikinetics公司的DAM儀器中進(jìn)行監(jiān)測(cè)，隔26h之后更換對(duì)照與實(shí)驗(yàn)組位置繼續(xù)監(jiān)測(cè)，使用pysolo進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，大于5分鐘活動(dòng)為0則認(rèn)為果蠅在睡眠。

3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSSl7.0軟件對(duì)果蠅壽命進(jìn)行分析和OASIS結(jié)合Python的lifelines庫(kù)(主要用于計(jì)算P—value)。

二、結(jié)果與分析

1、夏枯草水提物對(duì)果蠅壽命的影響

如表l所示不同濃度的夏枯草水提物對(duì)雌雄果蠅的平均壽命、最大壽命的影響，進(jìn)食最高濃度的夏枯草水提物的雌性果蠅壽命相比較對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05)，延長(zhǎng)平均壽命10.54％、中值壽命10％、最大壽命20％。其他濃度對(duì)雌性果蠅均沒(méi)有效果，所有濃度對(duì)于雄性果蠅均沒(méi)有效果。結(jié)果表明夏枯草水提物可以延長(zhǎng)果蠅的壽命，但是具有性別差異性。

2、夏枯草水提物對(duì)果蠅進(jìn)食量的影響

壽命與熱量的攝人有密切的關(guān)系，另外由于壽命實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)最高濃度的夏枯草水提物可以延長(zhǎng)雌性果蠅的壽命，所以需要確定這種延長(zhǎng)是否是通過(guò)抑制進(jìn)食量達(dá)到的。亮藍(lán)是一種藍(lán)色染料，果蠅進(jìn)食之后會(huì)使其腸道染色，從而根據(jù)亮藍(lán)含量的多少來(lái)檢測(cè)進(jìn)食量的多少，亮藍(lán)的含量可以通過(guò)在629nm處的吸光度來(lái)檢測(cè)，吸光度越大含量越高。

通過(guò)圖1分析得到，進(jìn)食高濃度夏枯草水提物之后會(huì)提高果蠅的進(jìn)食量，其中雌性提高24.42％(P＜0.05)。雄性提高37.4％(P＜0.05)。

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