目的：研究D-纈氨酸與L-纈氨酸對牙齦卟啉單胞菌及其生物膜的作用?方法：通過CCK-8實驗獲得無細(xì)胞毒性的D-纈氨酸濃度；通過生長曲線實驗評估D-纈氨酸與L-纈氨酸對牙齦卟啉單胞菌細(xì)菌活性的作用；通過結(jié)晶紫染色實驗?胞外多糖實驗和掃描電鏡評估D-纈氨酸與L-纈氨酸對牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的抑制作用和對成熟牙齦卟啉單胞菌生物膜的分散作用?結(jié)果：D-纈氨酸在濃度為50mmol/L和75mmol/L時對成纖維細(xì)胞無細(xì)胞毒性；D-纈氨酸(75mmol/L)能有效抑制牙齦卟啉單胞菌的細(xì)菌活性和生物膜的形成，并分散成熟的生物膜?D-纈氨酸(50mmol/L)在72h內(nèi)抑制牙齦卟啉單胞菌的生物活性和生物膜的形成?L-纈氨酸(75mmol/L和50mmol/L)促進(jìn)牙齦卟啉單胞菌的細(xì)菌活性和生物膜的形成?當(dāng)D-纈氨酸和L-纈氨酸同時存在時，僅表現(xiàn)出D-纈氨酸的作用?結(jié)論：D-纈氨酸具有抑制牙齦卟啉單胞菌細(xì)菌活性和生物膜形成，并分散成熟生物膜的作用；L-纈氨酸能促進(jìn)牙齦卟啉單胞菌的細(xì)菌活性和生物膜的形成，但其作用與D-纈氨酸不相拮抗?D-纈氨酸可作為治療菌斑生物膜相關(guān)疾病的潛在生物制劑?

種植體周圍炎和牙周炎是造成種植體脫落和牙體缺失的主要疾病，種植體周圍炎和牙周炎的治療是維護(hù)口腔健康的關(guān)鍵?致病菌菌斑生物膜的形成是種植體周圍炎和牙周炎的始動因素，生物膜形式致病菌的致病性和耐藥性是游離致病菌的500倍?牙齦卟啉單胞菌是種植體周圍炎和牙周炎的主要致病菌?牙齦卟啉單胞菌通過分泌脂多糖，牙齦蛋白酶和凝血酶等細(xì)胞外基質(zhì)緊密連接成膜狀結(jié)構(gòu)抵抗宿主免疫反應(yīng)，對牙齦卟啉單胞菌生物膜的清除，是治療種植體周圍炎和牙周炎的關(guān)鍵?臨床上對其治療方法主要有機(jī)械清理菌斑?激光治療和聯(lián)合抗生素藥物治療?然而，機(jī)械處理和不適當(dāng)波長的激光易破壞種植體表面和牙齒表面結(jié)構(gòu)，影響上皮的再附著?聯(lián)合抗生素治療在臨床上具有一定的效果，但抗生素的應(yīng)用可能造成耐藥菌株突變?nèi)允遣蝗莺雎缘膯栴}?因此，尋找一種有效控制致病菌斑并不產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性的生物制劑對種植體周圍炎和牙周炎的治療至關(guān)重要?

近年來，D-氨基酸與L-氨基酸對細(xì)菌及其生物膜的作用成為研究熱點?氨基酸是組成生命物質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，不會造成細(xì)菌基因突變而產(chǎn)生耐藥菌株?學(xué)者提出，L-氨基酸能促進(jìn)細(xì)菌活性和菌斑生物膜的形成?作為L-氨基酸的手性異構(gòu)分子，我們猜想D-氨基酸可能抑制細(xì)菌活性和抑制菌斑生物膜的形成?本項目組前期研究發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)3天時，D-纈氨酸(50~150mmol/L)可以抑制牙齦卟啉單胞菌菌斑生物膜的形成，并呈現(xiàn)濃度依賴性?但D-纈氨酸的細(xì)胞毒性尚未被報道?D-纈氨酸作用于細(xì)菌或僅抑制菌斑生物膜的形成仍不明確，D-纈氨酸與L-纈氨酸對牙齦卟啉單胞菌及其生物膜的作用亦未被闡述?本研究擬通過CCK-8實驗探討D-纈氨酸的細(xì)胞毒性；通過探討D-纈氨酸與L-纈氨酸對牙齦卟啉單胞菌及其生物膜的作用，獲得能有效抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜形成和分散成熟生物膜的D-纈氨酸濃度?以期為D-纈氨酸作為治療種植體周圍炎和牙周炎的潛在生物制劑提供理論基礎(chǔ)?

1材料與方法

1.1D/L-纈氨酸培養(yǎng)基的配制與實驗分組細(xì)胞實驗：D-纈氨酸(D-valine，D-val)溶解于細(xì)胞培養(yǎng)基中(50/75/100/125/150mmol/L)，經(jīng)0.22μm濾器過濾備用，對照組為單純細(xì)胞培養(yǎng)基?細(xì)菌實驗：D-纈氨酸與L-纈氨酸(L-valine，L-val)溶解于牙齦卟啉單胞菌培養(yǎng)基中，濃度和分組如下：D-val/50mmol/L，L-val/50mmol/L，D-val+L-val/50mmol/L+50mmol/L，D-val/75mmol/L，L-val/75mmol/L，D-val+L-val/75mmol/L+75mmol/L，對照組為單純牙齦卟啉單胞菌培養(yǎng)基?

1.2D-纈氨酸細(xì)胞毒性實驗小鼠成纖維細(xì)胞(L929)100μL以濃度5×104Cells/mL培養(yǎng)于96孔板?培養(yǎng)1d后換液為含有不同濃度D-纈氨酸的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每天換液?在培養(yǎng)后的第1?3?5天，通過CCK-8實驗檢測不同濃度的D-纈氨酸對小鼠成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響?無細(xì)胞毒性的D-纈氨酸濃度用于后續(xù)研究?

1.3D/L-纈氨酸對牙齦卟啉單胞菌活性的影響不同濃度的D-纈氨酸與L-纈氨酸與對數(shù)生長期的牙齦卟啉單胞菌(1.0×108CFU/mL，A=600)共培養(yǎng)于試管中，紫外分光光度計在600nm波長下每12h測定其濁度，持續(xù)至144h，記錄實驗數(shù)據(jù)并繪制時間-生長曲線?

1.4生物膜形成量實驗采用傳統(tǒng)的結(jié)晶紫染色實驗評估生物膜的形成和成熟生物膜的分散情況?生物膜形成抑制實驗：將不同濃度的D-纈氨酸與L-纈氨酸與對數(shù)生長期的牙齦卟啉單胞菌共培養(yǎng)于96孔板內(nèi)(1.0×108CFU/mL，A=600)，每組5個副孔，分別在培養(yǎng)3d和5d后采用結(jié)晶紫染色法評估D-纈氨酸與L-纈氨酸對牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的作用?成熟生物膜的分散實驗：對數(shù)生長期的牙齦卟啉單胞菌96孔板內(nèi)培養(yǎng)(1.0×108CFU/mL，A=600)，3d后形成成熟的牙齦卟啉單胞菌生物膜?去掉培養(yǎng)基保留孔板底部生物膜，更換含不同濃度的D-纈氨酸與L-纈氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)3d，采用結(jié)晶紫染色法評估D-纈氨酸與L-纈氨酸對牙齦卟啉單胞菌生物膜的分散作用?

1.5胞外多糖實驗和掃描電鏡觀察生物膜結(jié)構(gòu)采用硫酸-苯酚法測定胞外多糖，本實驗中紫外分光光度計和酶標(biāo)儀標(biāo)定波長為490nm?以不同濃度葡萄糖(0?10?20?30?40?60?80?100mg/L)繪制多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線?掃描電鏡觀察生物膜結(jié)構(gòu)實驗中紫外分光光度計標(biāo)定波長為600nm，采用24孔板培養(yǎng)牙齦卟啉單胞菌?生物膜形成抑制實驗與成熟生物膜的分散實驗分組及培養(yǎng)方式同結(jié)晶紫染色實驗?實驗步驟和操作方法同項目組前期研究?

1.6統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS24.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，檢測數(shù)據(jù)正態(tài)分布后，組間比較才有用方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義?使用Prism-graphpad8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計圖繪制?

聲明：本文所用圖片?文字來源《口腔醫(yī)學(xué)研究》2020年7月第36卷第7期，版權(quán)歸原作者所有?如涉及作品內(nèi)容?版權(quán)等問題，請與本網(wǎng)聯(lián)系

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