銀杏作為銀杏科植物唯一幸存樹種，有活化石之稱，其果、葉、根、花粉等均可入藥，其中銀杏葉的提取物有很高的生物活性和較好的藥用價值，可用作草本膳食補(bǔ)充劑和植物藥物。銀杏葉提取物作用主要集中在抗氧化、抗癌、緩解壓力、改善認(rèn)知功能（記憶力和注意力）和血液循環(huán)，預(yù)防并治療耳鳴、酒精性肝損傷、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病等。銀杏葉提取物中的生物活性主要?dú)w功于黃酮類和萜類化合物，故黃酮化合物和萜類化合物的含量指標(biāo)是判斷銀杏葉提取物質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。

銀杏葉及其提取物中黃酮含量檢測方法主要有分光光度法、近紅外法、熒光光度法、液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用等，其中液相色譜法具有儀器價格較低、操作簡單、準(zhǔn)確性高、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際中應(yīng)用較多。多數(shù)HPLC法測銀杏中黃酮含量時，先水解樣品，使其中的化合態(tài)黃酮轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)黃酮，以測出化合態(tài)和游離態(tài)之和一總黃酮含量，來判定其總黃酮質(zhì)量。有很多不法商販利用這一特性，在銀杏葉及其提取物中添加其他含槲皮素、山柰酚等較高的物質(zhì)，以達(dá)到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于銀杏葉提取物黃酮含量指標(biāo)要求，以次充好，對銀杏葉提取物的質(zhì)量判斷產(chǎn)生了一定的干擾，因此需要建立一種測定銀杏葉及其提取物中游離黃酮含量的方法。目前關(guān)于游離黃酮的研究多數(shù)集中在液質(zhì)聯(lián)用等較貴重儀器，HPLC法研究較少，如蒲擎宇等以甲醇為提取溶劑，檢測銀杏中槲皮素、山奈酚、異鼠李素3種游離黃酮含量，但該方法耗時長，加熱回流需6h，溶劑消耗大。

本文旨在建立可同測定銀杏葉及提取物中蘆丁、槲皮素、山柰酚、異鼠李素4種游離黃酮含量的方法，力求縮短檢測時間，降低能耗。同時評價市面上銀杏葉提取物中游離黃酮含量水平，分析原料及提取物之間對應(yīng)各游離黃酮含量關(guān)系，以期更好為企業(yè)生產(chǎn)提供技術(shù)支持和服務(wù)。

一、材料與方法

1、材料與儀器

蘆丁、槲皮素、山柰酚、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品，均購于sigma公司，純度分別為96.6％、99.5％、97.0％、95.0％；磷酸、甲醇、乙醇、超純水，其中甲醇為色譜純，其余均為分析純；銀杏葉3批、銀杏葉提取物3批。Waterse2695液相（配備紫外檢測器）；恒溫水浴鍋（配備冷凝回流系統(tǒng)）；超聲清洗器。

2、試驗(yàn)方法

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取蘆丁、槲皮素、山柰酚、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品6.06mg、4.67mg、6.00mg、1.07mg于50mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解后定容，即得0.1212mg/mL蘆丁、0.0934mg/mL槲皮素、0.1200mg/mL山柰酚、0.0214mg/mL異鼠李素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（2）銀杏供試樣品液的制備

銀杏葉：銀杏葉原料粉碎過篩混勻后，稱取5g樣品，100mL甲醇萃取后補(bǔ)重，混勻，過0.459m有機(jī)系濾膜，待測。

銀杏葉提取物：稱0.5g提取物于50rIlL容量瓶中，加入少量甲醇超聲溶解，冷卻至室溫，甲醇定容，混勻，過0.459m有機(jī)系濾膜，待測。

(3）4種游離黃酮含量的計算

C_樣=S_樣×C_標(biāo)×V×100/（S_標(biāo)×m_樣×1000）式中：C_樣為樣品中某一成分游離黃酮含量，％；S_樣為樣品中對應(yīng)游離黃酮峰面積；S_標(biāo)為對應(yīng)標(biāo)樣峰面積；m_樣為樣品稱樣量，g；V為樣品液定容體積。

二、結(jié)果與分析

1、色譜條件的優(yōu)化

通過優(yōu)化進(jìn)樣量（3μL、5μL和10μL）和洗脫程序（等度和梯度），確定優(yōu)化后色譜條件為：

色譜柱：AgilentEclipsePlusC18（4.6mm×100mm，3.5μm）柱溫：40⁰C；

進(jìn)樣量：5μL；

流動相：A：0.4％磷酸水溶液，B：甲醇，梯度洗脫程序見表1。

優(yōu)化后的色譜條件下銀杏葉提取物的液相圖譜如圖1所示。

2、銀杏葉前處理?xiàng)l件優(yōu)化0.2在其他條件一定的情況下，單因素實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證萃取方式、萃取時間、萃取溫度、回流時間對萃取效果的影響。

（1）萃取方式的選擇

稱取5g原料，加入100mL甲醇，采用超聲萃取和加熱回流萃取，比較超聲和回流兩種方式萃取效果，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在萃取時間分別為30min、60min、90min時，加熱回流萃取銀杏葉總游離黃酮含量均高于超聲回流方式，故銀杏葉萃取方式選為加熱回流。

（2）萃取時間的選擇

稱取5g原料，加入100mL甲醇，80℃加熱回流萃取銀杏原料選取原料，萃取時間分別為0min、5min、10min、20min、30min、60min、90min，對比結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，回流萃取30min時游離黃酮的結(jié)果已趨于穩(wěn)定，延長萃取時間檢測結(jié)果無明顯變化，故萃取時間選為30min。

通過單因素實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，優(yōu)化后銀杏葉中游離黃酮前處理?xiàng)l件為甲醇800C加熱回流30min。

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液做2倍梯度濃度稀釋，所得蘆丁、槲皮素、山柰酚、異鼠李素線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性方程見表2。

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