金櫻子（RoselaevigataMichx），別名刺榆子、金罌子、山石榴、金壺瓶、燈籠果等，為薔薇科常綠攀緣植物，主產(chǎn)于廣東、廣西、湖南、江西、浙江、江蘇、安徽等地，均為野生。成熟的金櫻子含有多糖、黃酮類、三萜類及其衍生物等各種化學(xué)成分。其用途廣泛，可用來釀酒、熬糖、加工飲料等。其提取物金櫻子棕色素初步推斷為黃酮類化合物，這類物質(zhì)具有良好的抗氧化活性功能，可通過清除自由基達到抗氧化效果。本文以金櫻子為原料，探索出一條提取金櫻子棕色素的新的工藝路線，該路線簡單易行，避免了使用毒性有機溶劑，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。同時本文采用FRAP法和DPPH法，以維生素C和BHT為對比物，初步探討了金櫻子棕色素的抗氧活性的能力。采用熒光和化學(xué)發(fā)光法測定色素清除羥自由基和超氧陰離子自由基的能力，以及其抑制亞油酸脂質(zhì)過氧化的作用，為提高金櫻子棕色素的利用價值提供依據(jù)。

一、實驗部分

1、實驗材料

（1）實驗原料與試劑

金櫻子干果（購自當(dāng)?shù)厮幍辏?；FeCl₃、Fe-SO₄、HCI、維生素C、H₂O₂、苯甲酸、醋酸、醋酸鈉、無水乙醇、95％乙醇、羅丹明B、三羥甲基氨基甲烷、二丁基羥基甲苯（BHT），以上試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；魯米諾（1uminol，Merck公司）；鄰苯三酚（Merck公司）；三吡啶三吖嗪（tripyridyhriazine，TPTZ，Sigma公司）；二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，Sigma公司）。試驗用水均為二重蒸餾水。

（2）實驗儀器

UV-1700紫外-可見分光光度計、微弱化學(xué)發(fā)光儀（尤尼柯（上海）器有限公司）；CaryEclipse熒光分光光度計（美國瓦里安公司）；BS200s電子分析天平（上海天平儀器廠）；超濾膜（自制）；AB-8大孔吸附樹脂（南開大學(xué)化工廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE52A（上海亞榮生化儀器廠）；DZF-6050型真空干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司）。

2、實驗方法
（1）金櫻子棕色素的提取工藝

金櫻子→去雜→干燥→粉碎→石油醚脫脂→乙醇水溶液浸提→過濾→濾渣→二次浸提→濾渣
 

（2）FRAP法測定金櫻子棕色素總抗氧化能力

FRAP法是基于氧化還原反應(yīng)的比色法。在較低的pH條件下Fe³⁺三吡啶三吖嗪（TPTZ）可被試樣中還原物質(zhì)還原為Fe²⁺形式，呈現(xiàn)出藍(lán)色，在波長593nm處具有最大光吸收，根據(jù)吸光度大小計算樣品抗氧化活性的強弱。

分別配制0.1g／L的金櫻子棕色素、BHT及維生素C溶液作為樣品，F(xiàn)RAP工作液為10.0mmol／LTPTZ溶液、20.0mmol／LFeCl3溶液和0.3mmol／L醋酸鈉緩沖液以1∶1∶10組成的混合物。用微量移液器分別精確吸取色素溶液、BHT溶液、維生素C溶液0.1mL，分別加入預(yù)熱至37℃的1.80mLTPTZ工作液混勻，終反應(yīng)液用各自溶劑補足至5.00mL，37℃反應(yīng)10min，分別以各自溶劑為空白對照，測定593nm處的吸光度值（A），以1.00mmol／LFeSO₃為標(biāo)準(zhǔn)，樣品抗氧化活性以達到同樣吸光度所需的FeSO₄的毫摩爾數(shù)表示。

FeSO₄標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密移取0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mmoVLFeS0₄標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.10mL分別置于5只微量試劑瓶中，分別加入預(yù)熱至37℃的1.80mLFRAP工作液并用蒸餾水補足至5.0mL，混勻，37℃反應(yīng)10min，以試劑做空白，在波長593nm處測定吸光度值，以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，計算回歸方程。

（3）DPPH法測定金櫻子棕色素抗氧化活性

DPPH是一種穩(wěn)定的有機自由基，其乙醇溶液呈紫色，在可見光區(qū)最大吸收峰為517nm。當(dāng)DPPH溶液中加入自由基清除劑時，溶液顏色變淺，A_517nm。值變小，而且吸光度變小的程度與自由基被清除的程度呈線性關(guān)系。因此可用自由基的清除情況來評價某物質(zhì)的抗氧化能力，其抗氧化能力用清除率來表示，清除率越大，抗氧化能力越強。

先用無水乙醇配制2×10^-4mol／L的DPPH·溶液，同時分別稱取一定量金櫻子棕色素、BHT和維生素C用蒸餾水溶解，并將其稀釋為以下濃度：0.01、0.02、0.03、0.04、0.059／L，作為測試液。用微量移液器精確吸取測定液2.0mL與DPPH溶液2.0mL混合，搖勻后放置30min，以無水乙醇為對照，測定波長517nm處的吸光度值A(chǔ)O同時測定2.0mLDPPH·溶液與2.0mL無水乙醇混合液的吸光度Ao，以及2.0mL測定液與2.0mL無水乙醇混合液的吸光度A₁，根據(jù)下列公式計算測定液對DPPH·的清除率。按以上測試方法分別測定其清除率，得出直線回歸方程，進而計算其50％清除率（IC₅₀）。

清除率=[1一（A—A1）／Ao×100％

式中：A為加測試液后DPPH的吸光度；A₁為測定液在測定波長吸光度；Ao為未加測定液時DPPH的吸光度。

（4）金櫻子棕色素清除超氧陰離子的能力

采用魯米諾—鄰苯三酚體系。鄰苯三酚在堿性條件下能迅速的發(fā)生自氧化，產(chǎn)生一系列的有色產(chǎn)物。鄰苯三酚與魯米諾體系為快速發(fā)光，能在鄰苯三酚自氧化速率呈線性的時間內(nèi)達到發(fā)光峰值。色素中的抗氧化物質(zhì)可以抑制超氧陰離子，降低其濃度，從而減弱發(fā)光強度。發(fā)光強度的降低值與色素中抗氧化物質(zhì)清除O₂^-自由基的能力成正相關(guān)，因此，可以間接地測定色素對O₂^-自由基清除的能力。

在測定管中加入1.0mmoL／L魯米諾（用0.1mol／L的碳酸鈉溶液配成）2.OmL，加入不同量的色素（水乳濁液）溶液（或用同體積的雙蒸水做空白），再注入20μL蒸餾水，最后加入10.0mmol／L鄰苯三酚20μL起動反應(yīng)，快速混勻，立即置入樣品室中，在319.5nm波長處每間隔lmin測吸光值一次，共反應(yīng)5min。每個樣品平行做三次，取平均值，按下式計算清除率。

清除率=（CL₀-CL）／CL_o×100％

式中：CL₀為空白試驗吸光度；CL為測試液吸光度。

（5）金櫻子棕色素清除羥自由基的能力

采用羅丹明B-Fenton體系。Fenton反應(yīng)是以過氧化氫為氧化劑，以亞鐵鹽為催化體系的氧化反應(yīng)方法，在反應(yīng)中可產(chǎn)生羥自由基（·OH）。羅丹明B是一種熒光染料，本身能產(chǎn)生特征熒光，其激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為358nm和575nm。Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生的·OH可以迅速氧化羅丹明B，使羅丹明B的熒光強度顯著降低，從而間接測定羥自由基的產(chǎn)生量。

羥自由基檢測：在測試管中依次加入Tris—HCL緩沖溶液（pH5.5）6.0mL，1.92×10^-3mmol／L羅丹明B溶液19.2uL，4.08mmol／LH₂0₂溶液0.48mL，0.64mmol／LFeS0₄溶液1.28mL，搖勻，反應(yīng)5min后，用蒸餾水補足終體積至10.0mL。15min后在358nm激發(fā)波長下測定575nm處的熒光強度F，計算其與空白參比（羅丹明B與緩沖溶液）熒光強度F₀之差△F。

在上述體系中，加入不同濃度的色素水乳濁液，測定熒光強度Fs；未加Fenton試劑與色素的體系為空白體系，測定熒光強度F₀；則清除率按以下公式計算。

清除率=（F₀一Fs）／F0×100％

（6）金櫻子棕色素抑制亞油酸脂質(zhì)過氧化作用

Fe²⁺／亞油酸體系中，過渡金屬離子如Fe²⁺等，可以通過多種途徑促進脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的進行。亞油酸是多不飽和脂肪酸，暴露在有氧環(huán)境中會發(fā)生自動氧化，實驗時提高環(huán)境溫度可以加速其氧化過程，通過測定其添加樣品后的過氧化水平，并與空白對照比較，可以評價樣品的抗脂質(zhì)過氧化活性。

2mL樣品溶液加入亞油酸乳濁液2.5mL，2.5mL磷酸鹽緩沖液（0.2mol／L，pH7.0），0.1mL501xmol／L的氯化亞鐵溶液，0.1mL50μmoL／L的維生素C溶液，37℃保溫24h，每8h取0.1mL加入5mL75％乙醇，0.1mL30％的硫氰酸銨，0.1mL20mmol／L的氯化亞鐵的3.5％HCL溶液（新鮮配制），室溫下放置3min，磷酸鹽緩沖液調(diào)零，以不加樣品為空白，500nim下測定吸光度。抑制率計算公式：

抑制率（％）=（A_空白一A_樣品）／A_空白×100

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