牦牛乳口感香濃，具有“高濃度、高比重、高含量”的特點，發(fā)酵牦牛乳是一種以牦牛奶為原料，經(jīng)殺菌、接種發(fā)酵劑發(fā)酵制成的傳統(tǒng)飲品。發(fā)酵乳的質(zhì)量優(yōu)劣與牛奶種類、乳固形物含量、牛奶理化特性及發(fā)酵劑等因素密切相關(guān)。為得到品質(zhì)更好的發(fā)酵乳，多種菌株發(fā)酵是發(fā)酵乳的討論熱點，許榮譽等研究發(fā)現(xiàn)約氏乳桿菌和羅伊氏乳桿菌具有耐強酸的能力和良好的發(fā)酵特性；于素素等發(fā)現(xiàn)含有發(fā)酵乳桿菌的發(fā)酵牦牛乳具有良好的性能及風(fēng)味；Rodriguezl等用約氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵牛乳，比普通發(fā)酵乳具有更好的物質(zhì)代謝率。發(fā)酵乳的口感與牛奶種類也有關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)，牦牛奶脂肪和干物質(zhì)含量高導(dǎo)致其發(fā)酵制品存在質(zhì)地硬、香味不足等缺點。為提高單一乳發(fā)酵制品的品質(zhì)，國外常把山羊奶與荷斯坦牛奶或水牛奶混合后發(fā)酵。

為開發(fā)優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵牦牛乳制品，本研究從10株乳酸菌中篩選適合牦牛乳發(fā)酵的3株菌，并與保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌制成發(fā)酵劑。根據(jù)牦牛乳高蛋白質(zhì)和高脂肪的特點，加入荷斯坦牛奶混合發(fā)酵，彌補單一牦牛乳發(fā)酵制品中存在的膻味較重、質(zhì)地較硬等問題，為生產(chǎn)高品質(zhì)牦牛發(fā)酵乳提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

牦牛乳（香格里拉高山牧場）；菌株：保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌，植物乳桿菌，嗜酸乳桿菌，干酪乳 桿菌，副干酪乳桿菌，嬰兒雙歧乳桿菌，約氏乳桿菌，發(fā)酵乳桿菌，羅伊氏乳桿菌。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵乳菌株篩選

將10種乳酸菌株分別接種到10mL滅菌MRS培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)活化?；罨蟮木N接種到脫脂牛乳中馴化增殖，菌種接種量為6%、4%、2%，40℃下恒溫培養(yǎng)至凝乳。通過測定發(fā)酵乳的酸度、乳酸菌數(shù)、凝乳時間確定適宜發(fā)酵菌種。

1.2.2 復(fù)合菌種配比

根據(jù)前期試驗，將經(jīng)1.2.1試驗篩選出的3種菌株與保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌按體積比1:1:1:1:1進行馴化（該比例下菌株協(xié)調(diào)共生，發(fā)酵性能最佳）。將馴化后的菌種按5%的添加量接種到脫脂奶粉培養(yǎng)基（含2%pH值6.86的PBS，2%番茄汁、6%胡蘿卜汁、8%馬鈴薯汁）中培養(yǎng)至凝乳，加入冷凍干燥保護劑（20mL/L甘油、8g/L葡萄糖、20g/L抗壞血酸）于-80℃凍結(jié)后于-50℃、1~3MPa冷凍干燥72h，制成直投式復(fù)合發(fā)酵劑，于-20℃冰箱內(nèi)冷藏備用。

1.2.3 發(fā)酵乳加工工藝設(shè)計

原料乳→預(yù)熱（50~60℃）→均質(zhì)（8～10MPa）→殺菌（85℃巴氏殺菌，10~20min）→冷卻→接種→灌裝→發(fā)酵→冷藏后熟→成品。

1.2.4 牦牛奶與荷斯坦牛奶的比例確定

將牦牛奶、荷斯坦牛奶分別按3:1、2:1、1:1、1:2、1:3比例加工制作為發(fā)酵乳，測定其感官評分，pH值、酸度、黏度及持水率，以確定最佳配比。

1.2.5 發(fā)酵乳工藝單因素試驗

以發(fā)酵乳感官評分為指標(biāo)，分別研究糖添加量（8%、8.5%、9%、9.5%、10%）、菌種添加量（2%、3%、4%、5%、6%）、發(fā)酵溫度（26℃、28℃、30℃、32℃、34℃）、發(fā)酵時間（20h，25h、30h、35h、40h）四個因素對其的影響。

1.2.6 發(fā)酵工藝優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面Bo x —Behnken試驗設(shè)計，選取糖添加量、菌種添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間進行4因素3水平響應(yīng)面分析，在中心值重復(fù)3次，以發(fā)酵乳感官評分為指標(biāo)優(yōu)化工藝參數(shù)。

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1 感官評分

組織10人評價小組，從色澤、氣味、滋味及組織狀態(tài)四個方面對發(fā)酵乳進行打分，評分標(biāo)準如表1所示。

1.3.2 發(fā)酵牦牛乳理化指標(biāo)測定

pH值：使用PHSJ-3F型pH計直接測定；持水力：參照Hassan的方法進行測定；酸度：參照GB 5009.239-2016進行測定；蛋白質(zhì)：參照GB5009.5-2016進行測定；脂肪：參照GB5009.6-2016進行測定。

1.3.3 發(fā)酵牦牛乳風(fēng)味成分雙乙酰的測定

用三氯乙酸溶液將樣品稀釋后，取10支試管加入0.0、2.0、4.0、6.0﹑8.0mL標(biāo)準液（各2支），用蒸
餾水補足至10mL后，加入5mL三氯乙酸溶液。一組加0.5mL鄰苯二胺溶液，另一組做空白對照，暗處放
置30min后在335nm波長下測定吸光值。雙乙酰含量（mg/L）=吸光度×1.2（換算系數(shù)）[10,11]。

1.3.4 發(fā)酵牦牛乳微生物指標(biāo)檢測

乳酸菌計數(shù)：參考GB4789.35-2016；大腸菌群計數(shù)：參考GB4789.3-2016；霉菌、酵母計數(shù)：參考GB4789.15-2016。

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