D₃同樣是脂溶性維生素和微囊化產(chǎn)品，在樣品中含量更低（0.5～1.0μg/g）。中國(guó)藥典二部對(duì)于D₃化學(xué)純品，用HPLC正相色譜、紅外進(jìn)行鑒別。借鑒Jiao等對(duì)于牛奶中痕量維生素D用石墨烯磁性固相萃取柱純化富集樣品，HPLC法分離測(cè)定及GB5009.82-2016維生素D₃的HPLC測(cè)定的方法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)。樣品用稀氨水超聲打破囊壁和無(wú)水乙醇溶解，再用正己烷提取后正相色譜分離鑒別。省去了石墨烯固相萃取柱純化樣品及國(guó)標(biāo)法中皂化、石油醚提取、洗滌及真空干燥等繁瑣步驟。方法的檢測(cè)限為7ng/g，符合鑒別要求。經(jīng)分析，上述2種HPLC法亦能有效地證明樣品中真實(shí)存在維生素K₁和D₃。

6、鹽酸氨基葡萄糖的含量測(cè)定方法

（1）色譜分離圖

在鑒別勁骨膠囊配方中所有的功效成分后，精密稱取膠囊內(nèi)容物20mg，于三角瓶中，先加1mL乙腈使樣品濕潤(rùn)分散，再加適量水超聲提取5min，取出，放至室溫，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，作為樣品溶液；精密稱取鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品10mg，于25mL容量瓶中，先加1mL乙腈濕潤(rùn)分散，用水定容至刻度，搖勻，制成400μg/mL對(duì)照品溶液的方法對(duì)其最主要的功效成分鹽酸氨基葡萄糖進(jìn)行了含量測(cè)定。結(jié)果顯示，對(duì)照品及樣品色譜峰均達(dá)到基線分離，主峰只有1個(gè)，保留時(shí)間一致，峰形狹窄對(duì)稱，無(wú)雜峰干擾，符合定量要求，如圖9所示。同時(shí)此方法動(dòng)相用乙腈-0.4%（mL/mL）磷酸（三乙胺調(diào)至pH3.0）（4:96，V:V）替代乙腈-離子對(duì)試劑，可提高色譜柱的使用壽命，減少管道堵塞，使測(cè)定更加簡(jiǎn)便快捷。

（2）方法學(xué)驗(yàn)證

①線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、方法檢測(cè)限及定量限

鹽酸氨基葡萄糖在96～1200μg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為Y=778.82X+6774.80，相關(guān)系數(shù)r2=0.9999，按樣品最低濃度測(cè)出的信噪比3:1確定方法的檢測(cè)限為1.2μg/mL，按信噪比10:1確定方法的定量限為3.8μg/mL。

呈直線回歸，相關(guān)性好，線性范圍寬，方法檢測(cè)限和定量限低。

②樣品測(cè)定方法精密度實(shí)驗(yàn)

選定樣品某一最適濃度，重復(fù)測(cè)定6次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.72%，說明本方法重現(xiàn)性好，精密度高。

③樣品回收率實(shí)驗(yàn)

在線性范圍內(nèi)采用加標(biāo)回收的方法進(jìn)行測(cè)定。選定已知濃度樣品作為本底，以其濃度為1，按低、中、高，即0.5:1、1:1、1.5:1左右濃度的對(duì)照品加入本底中，每個(gè)濃度重復(fù)3次，共9個(gè)樣品。通過供試品中含量值、對(duì)照品加入量和測(cè)定值計(jì)算回收率和RSD。經(jīng)測(cè)定計(jì)算，結(jié)果見表1，低濃度平均回收率為99.78%，RSD為0.22%；中濃度平均回收率為100.40%，RSD為0.17%；高濃度平均回收率為100.01%，RSD為0.49%，具有較高的準(zhǔn)確性。
 

7、樣品中鹽酸氨基葡萄糖含量的測(cè)定

在方法學(xué)驗(yàn)證基礎(chǔ)上，對(duì)連續(xù)3批勁骨膠囊中鹽酸氨基葡萄糖的含量進(jìn)行定量測(cè)定，產(chǎn)品各批含量基本一致，RSD為0.48%，如表2所示。說明產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，測(cè)定結(jié)果重復(fù)性好、靈敏度和精確度較高。

四、結(jié)論與討論

本研究建立了對(duì)勁骨膠囊功效成分的鑒別方法，在鹽酸氨基葡萄糖的薄層色譜鑒別中，增加了樣品用石油醚脫脂純化步驟，并在展開劑中加入茚三酮顯色劑，使展開和顯色同時(shí)進(jìn)行，取得較好的效果。在白芍提取物的鑒別中，增加了樣品用正丁醇純化樣品步驟，使樣品能很好分離芍藥苷，同時(shí)在薄層中設(shè)計(jì)了對(duì)照提取物、對(duì)照藥材、對(duì)照品多個(gè)參照物，比藥典僅用1個(gè)參照物鑒別效果更具說服力和可信度。在維生素K₁和D₃的HPLC法鑒別中，樣品微囊破壁和提取同步進(jìn)行，比國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)有較大改進(jìn)，簡(jiǎn)化了很多繁瑣操作步驟，節(jié)省時(shí)間，節(jié)約試劑，提高鑒別效果。同時(shí)本文對(duì)HPLC法測(cè)定鹽酸氨基葡萄糖含量進(jìn)行了優(yōu)化，選擇通用的C18反相柱和紫外檢測(cè)器，采用簡(jiǎn)便的提取方法，優(yōu)化流動(dòng)相的組成、比例和pH值，提高了測(cè)定精密度和準(zhǔn)確度。上述鑒別和含量測(cè)定方法專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、靈敏度高，可管控產(chǎn)品質(zhì)量。

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