④薄層色譜法

取膠囊內(nèi)容物50mg于分液漏斗中，加水10mL溶解，加石油醚（30～60⁰C）20mL，振搖，靜置分層，取下層液過濾，作為樣品溶液；取鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品10mg，加水5mL溶解，作為對(duì)照品溶液；按樣品配方和工藝制成不含鹽酸氨基葡萄糖膠囊內(nèi)容物50mg，與樣品同法制成陰性樣品溶液。

取上述3種溶液各3～5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄板上，以正丁醇-乙醇-冰醋酸-水=（4:1:1:2，V:V:V:V）為展開劑（按展開劑體積1mL加入1mg茚三酮，混勻），展開，取出，晾干，60⁰C烘箱加熱10min，至斑點(diǎn)顯色清晰，在日光燈下檢視。

（2）白芍提取物鑒別

取膠囊內(nèi)容物2g，加乙醇40mL，超聲提取20min，過濾，濾液水浴蒸干，殘?jiān)铀?0mL溶解，加水飽和正丁醇溶液振搖提取2次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)右掖?mL溶解，作為樣品溶液；取白芍對(duì)照提取物1g，加乙醇30mL，與樣品同法制成對(duì)照提取物溶液；取白芍對(duì)照藥材0.5g，加乙醇10mL，與樣品同法制成對(duì)照藥材溶液；取芍藥苷對(duì)照品適量，加乙醇制成1mg/mL溶液，作為對(duì)照品溶液；按樣品配方和工藝制成不含白芍及白芍提取物膠囊內(nèi)容物2g，與樣品同法制成陰性樣品溶液。

取上述5種溶液各5～10μL分別點(diǎn)于同一硅膠G薄板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40:5:10:0.2，V:V:V:V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%（g/mL）香草醛硫酸溶液，65⁰C烘箱加熱10min，至斑點(diǎn)顯色清晰，在日光燈下檢視。

（3）碳酸鈣鑒別

①稀鹽酸反應(yīng)法

取膠囊內(nèi)容物0.2g，于10mL試管中，作為樣品；取對(duì)照品碳酸鈣0.1g，于10mL試管中，作為對(duì)照品；按樣品配方和工藝制成不含碳酸鈣膠囊內(nèi)容物0.2g，與樣品同法制成陰性樣品。在上述3支試管中分別滴入稀鹽酸試液，觀察反應(yīng)。

②草酸銨試液沉淀法

取膠囊內(nèi)容物2.5g，于坩堝中先炭化，轉(zhuǎn)入600⁰C高溫馬弗爐中熾灼3～4h，殘?jiān)?5mL稀鹽酸試液溶解，過濾至50mL具塞試管中，加1滴甲基紅試液，用氨試液調(diào)至黃色，再加數(shù)滴稀鹽酸試液使呈酸性，作為樣品溶液；取碳酸鈣對(duì)照品0.6g于50mL具塞試管中，加15mL稀鹽酸試液溶解，與樣品同法制成對(duì)照品溶液；按樣品配方和工藝制成不含碳酸鈣膠囊內(nèi)容物2.5g，與樣品同法制成陰性樣品溶液。

在上述3支試管中分別滴加草酸銨試液，觀察反應(yīng)現(xiàn)象和顏色（稀鹽酸、甲基紅、氨試液、草酸銨試液參考中國藥典四部配制）。

（4）維生素K1鑒別

取膠囊內(nèi)容物2g，于三角瓶中，加0.03mol/L鹽酸溶液5mL，60⁰C超聲提取10min，加無水乙醇30mL，繼續(xù)超聲20min，取出，放至室溫，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，作為樣品溶液；取維生素K1對(duì)照品適量，加無水乙醇溶解，制成2μg/mL，作為對(duì)照品溶液；按樣品配方和工藝制成不含維生素K1膠囊內(nèi)容物2g與樣品同法制成陰性樣品溶液。

將上述3種溶液用0.22μm濾膜過濾，采用高效液相色譜儀測定。

色譜柱C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相:甲醇100%；檢測波長248nm；柱溫30⁰C；進(jìn)樣量10μL。

（5）維生素D3鑒別

取膠囊內(nèi)容物5g，于具塞試管中，加0.02%（mL/mL）氨水溶液10mL和無水乙醇25mL，60℃超聲提取10min，取出，放至室溫，吸取正己烷10mL于試管中，搖勻，倒入離心管中，3000r/min離心10min，取上層正己烷作為樣品溶液；取維生素D3對(duì)照品適量，加正己烷溶解，制成0.8μg/mL，作為對(duì)照品溶液；按樣品配方和工藝制成不含維生素D3膠囊內(nèi)容物5g，與樣品同法制成陰性樣品溶液。

將上述3種溶液用0.22μm濾膜過濾，采用高效液相色譜儀測定。

色譜柱:硅膠柱（3.9mm×150mm，5μm）；流動(dòng)相:正己烷-環(huán)己烷-異丙醇（50:50:0.8，V:V:V）；檢測波長265nm:柱溫:30℃；進(jìn)樣量:20μL。

（6）鹽酸氨基葡萄糖含量測定

精密稱取膠囊內(nèi)容物20mg，于三角瓶中，先加1mL乙腈使樣品濕潤分散，再加適量水超聲提取5min，取出，放至室溫，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，作為樣品溶液；精密稱取鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品10mg，于25mL容量瓶中，先加1mL乙腈濕潤分散，用水定容至刻度，搖勻，制成400μg/mL對(duì)照品溶液。

將上述2種溶液用0.22μm濾膜過濾，采用高效液相色譜儀測定。

色譜柱:C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相:乙腈-0.4%（mL/mL）磷酸（三乙胺調(diào)至pH3.0）（4:96，V:V）；檢測波長:95nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量:10μL。

方法學(xué)驗(yàn)證:參照中國藥典四部藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則進(jìn)行。

三、結(jié)果與分析

1、鑒別鹽酸氨基葡萄糖

（1）堿性酒石酸銅反應(yīng)法

取膠囊內(nèi)容物200mg，于10mL試管中，加水5mL溶解，作為樣品溶液；取鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品0.1mg，與樣品同法制成對(duì)照品溶液；按樣品配方和工藝制成不含鹽酸氨基葡萄糖膠囊內(nèi)容物200mg，與樣品同法制成陰性樣品溶液的方法實(shí)驗(yàn)后觀察，樣品和對(duì)照品溶液生成紅色Cu₂O沉淀，陰性樣品溶液則無此反應(yīng)，如圖2所示?；瘜W(xué)反應(yīng)式如下:C₆H₁₂O₆+2Cu²⁺+4OH-=C₆H₁₂O₇+Cu₂O↓（紅色）+2H₂O。

（2）硝酸銀反應(yīng)法

制法與堿性酒石酸銅反應(yīng)法相同，在水溶解的3支試管中，加入數(shù)滴稀硝酸試液，使呈酸性，滴加硝酸銀試液，觀察反應(yīng)顏色，樣品和對(duì)照品溶液生成白色絮狀A(yù)gCl沉淀，陰性樣品溶液則無此反應(yīng)，如圖3所示。化學(xué)反應(yīng)式如下:HCl+AgNO₃=AgCl↓（白色）+HNO₃。

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