銀杏（Ginkgobiloba）為銀杏科銀杏屬植物，是我國(guó)特有的中生代孑遺樹種。銀杏種仁（白果）為衛(wèi)計(jì)委認(rèn)定的藥食同源物質(zhì)，具有益氣、潤(rùn)肺和定喘等功能。銀杏營(yíng)養(yǎng)成分豐富，干制品中蛋白含量13.2%，碳水化合物含量72.6%，粗脂肪含量1.3%，此外還含有豐富的維生素E及多種礦質(zhì)元素。銀杏蛋白以清蛋白和球蛋白為主，氨基酸組成合理，必需氨基酸占比高，屬于優(yōu)質(zhì)植物蛋白。鄧乾春等研究表明，銀杏白蛋白具有較好的清除超氧陰離子和拮抗DNA氧化損傷的活性，銀杏清蛋白可通過免疫調(diào)節(jié)和抗氧化能力發(fā)揮對(duì)衰老小鼠、免疫抑制小鼠和S180腫瘤小鼠的保護(hù)作用。

植物蛋白的提取有物理壓榨和溶劑浸提法等，其中溶劑浸提法是最常使用的方法。溶劑浸提法主要有水提酸沉法（waterextractionandacidprecipitation,WEAP）、堿提酸沉法（alkaliextractionandacidprecipitation,AEAP）和鹽提鹽析法，以及各種輔助提取技術(shù)，如超聲輔助提取、微波輔助提取、酶輔助提取、反膠團(tuán)萃取和雙水相萃取等。目前已有數(shù)篇關(guān)于銀杏蛋白提取工藝的研究報(bào)道，李盼盼等優(yōu)化了銀杏蛋白超聲輔助提取的工藝參數(shù)，賈韶千等報(bào)道了銀杏蛋白堿法提取的最佳工藝，陳西娟考察了銀杏蛋白的鹽提鹽析法的工藝條件。研究表明功能活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物活性會(huì)受到提取方法的影響。彭倩等發(fā)現(xiàn)堿提酸沉法和鹽溶法提取的腰果蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性具有顯著性差異。職士淇等研究表明超聲輔助堿提、鹽提和水提制備的青葉苧麻葉蛋白質(zhì)的功能特性各有優(yōu)劣。有關(guān)提取方法對(duì)銀杏蛋白功能特性和抗氧化活性的研究未見報(bào)道。

本研究采用WEAP、AEAP和超聲輔助堿提酸沉法（ultrasound-assistedalkaliextractionandacidprecipitation,UA-AEAP）三種方法制備銀杏蛋白，考察提取方法對(duì)銀杏蛋白溶解度、起泡性、起泡穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性等功能特性的影響，同時(shí)考察提取方法對(duì)銀杏蛋白螯合亞鐵離子能力、清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基能力和清除羥基自由基能力的影響，旨在為銀杏蛋白資源的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮銀杏2020年10月采自江蘇邳州；牛血清白蛋白、DPPH、十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate,SDS）、菲啰嗪美國(guó)Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。FA2104N電子分析天平、723C可見分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；K9840自動(dòng)凱氏定氮儀濟(jì)南海能儀器股份有限公司；LGJ-18A冷凍干燥機(jī)北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；SHZ-D（Ш)循環(huán)水式真空泵鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

新鮮銀杏去外種皮、脫殼后，60℃下烘干至恒重，粉碎過60目，加入4倍體積石油醚，浸泡24h脫脂，得到脫脂銀杏粉。

1.2.2 銀杏蛋白的制備

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了不同提取方法的工藝參數(shù)。WEAP提取條件：取50g脫脂銀杏粉，按液料比20:1mL/g分別加入去離子水，提取溫度60℃，提取時(shí)間2h。AEAP提取條件：按液料比20:1mL/g將脫脂銀杏粉與NaOH溶液混合，調(diào)pH10.0，提取溫度60℃，提取時(shí)間2h。UA-AEAP工藝參數(shù)：液料比20:1mL/g，超聲功率200W，超聲處理時(shí)間20min，提取溫度60℃，提取時(shí)間40min。提取后，3500r/min離心20min，收集上清液，調(diào)pH至銀杏蛋白的等電點(diǎn)4.4，4500r/min離心20min，所得沉淀透析（截留相對(duì)分子質(zhì)量3500Da）72h，濃縮，冷凍干燥，得銀杏蛋白。

1.2.3 銀杏蛋白得率及其化學(xué)成分的測(cè)定

蛋白含量的測(cè)定：GB50095-2016凱氏定氮法；總糖含量的測(cè)定：苯酚硫酸法；粗脂肪含量的測(cè)定：5009.6-2016索氏抽提法；灰分含量的測(cè)定：GB5009.4-2016重量分析法。

銀杏蛋白得率計(jì)算公式如下：

1.2.4 銀杏蛋白溶解度的測(cè)定

將100mg銀杏蛋白溶于20mL去離子水中，調(diào)pH為2～12，室溫下攪拌30min，4500r/min離心20min，收集上清液。考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中銀杏蛋白的含量。

1.2.5 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定

定取500mg銀杏蛋白分散于15mL0.01mol·L^-1磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0）中，記錄初始體積為V₁（mL），10000r/min均質(zhì)2min，記錄泡沫體積為V₂（mL），靜置30min記錄體積記為V₃（mL）。銀杏蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的計(jì)算公式如下：

1.2.6 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

取200mg銀杏蛋白分散于20mL0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0）中，室溫下攪拌30min，加入5mL大豆油，10000r/min均質(zhì)2min。吸取100μL乳液，加入5mLSDS，混勻，測(cè)定500nm處的吸光度。銀杏蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的計(jì)算公式如下：

式中：N為稀釋倍數(shù)；A₁和A₂分別為0和30min時(shí)的吸光度；c為蛋白濃度，g/mL；θ為乳液中油相體積分?jǐn)?shù)；Δt為兩次吸光度測(cè)定的間隔時(shí)間，min。

1.2.7 亞鐵離子螯合能力測(cè)定

采用Decker報(bào)道的方法，并稍加修改。將1mL銀杏蛋白溶液（0.01～10g/L）與3.7mL55%（v/v)乙醇、0.1mL氯化亞鐵（2mmol/L）和0.2mL菲啰嗪（5mmol/L）混勻，靜置20min，測(cè)定562nm處的吸光度。55%乙醇代替樣液作為空白對(duì)照。EDTA（0.01～10g/L）作為陽性對(duì)照。亞鐵離子螯合率計(jì)算公式如下：

亞鐵離子螯合率(%)=(A_b-As)/A_b×100式（6）

式中：A_b和As分別為空白對(duì)照組和樣品組的吸光度。

1.2.8 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考Wu等報(bào)道的方法。取1.5mL銀杏蛋白溶液（0.1～6g/L），加入1.5mLDPPH溶液（0.2mmol/L），混勻，室溫下置于暗處30min，測(cè)定517nm處的吸光度。抗壞血酸（0.05～4g/L）做陽性對(duì)照。

式中：Ac為1.5mL蒸餾水與1.5mLDPPH混合液的吸光度；As為1.5mL樣液與1.5mLDPPH混合液的吸光度；A_b為1.5mL樣液與1.5mL95%乙醇混合液的吸光度。
 

相關(guān)鏈接：石油醚，菲啰嗪，抗壞血酸，磷酸鹽

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