2.3 染料木素和維生素D₃對(duì)破骨細(xì)胞增殖及其TRAP活性的影響

RAW264.7細(xì)胞用含50ng/mLRANKL的培養(yǎng)基培養(yǎng)6d，如圖4所示，RAW264.7細(xì)胞可誘導(dǎo)為圓形、橢圓形或不規(guī)則多核破骨細(xì)胞，并在細(xì)胞周?chē)梢钥吹酵蛊鸬膫巫恪１砻鱎AW264.7細(xì)胞可誘導(dǎo)為成熟的破骨細(xì)胞用于試驗(yàn)。

通過(guò)MTT法測(cè)定染料木素和維生素D₃作用6d對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。如圖5a所示，1.56～50.00μmol/L濃度的染料木素對(duì)RAW264.7細(xì)胞無(wú)毒性，如圖5b所示，3.12～100.00μmol/L濃度的維生素D₃對(duì)RAW264.7細(xì)胞無(wú)毒性。

通過(guò)MTT法測(cè)定染料木素和維生素D₃作用24h對(duì)破骨細(xì)胞增殖的影響。如圖6a所示，濃度在1.56～50.00μmol/L范圍內(nèi)染料木素對(duì)破骨細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用。如圖6b、6d所示，濃度在6.25～50.00μmol/L范圍內(nèi)維生素D₃對(duì)破骨細(xì)胞增殖具有顯著的促進(jìn)作用，與染料木素聯(lián)合使用后，這種促進(jìn)作用受到抑制。與對(duì)照組相比，聯(lián)合組在3.12～50.00μmol/L濃度下破骨細(xì)胞的增殖受到顯著抑制，而在3.12～25.00μmol/L濃度下，與染料木素組相比，破骨細(xì)胞的增殖受到抑制。結(jié)果表明，維生素D₃可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖，但與染料木素結(jié)合可以抑制破骨細(xì)胞的增殖。

采用TRAP試劑盒測(cè)定藥物作用于破骨細(xì)胞24h后對(duì)TRAP活性的影響。如圖7所示，染料木素、維生素D₃和聯(lián)合用藥組均顯著抑制破骨細(xì)胞的TRAP酶活性。聯(lián)合用藥組相比單藥抑制作用更強(qiáng)。

2.4 染料木素和維生素D₃對(duì)破骨細(xì)胞TRAP，MMP9和組織蛋白酶KmRNA表達(dá)的影響

如圖8a所示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組中破骨細(xì)胞的TRAPmRNA表達(dá)均被抑制，且聯(lián)合組的抑制作用更顯著。如圖8b所示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組中對(duì)破骨細(xì)胞TRAPmRNA表達(dá)抑制作用隨濃度增加而減弱。如圖8c和8d所示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組破骨細(xì)胞中MMP9mRNA的表達(dá)均被抑制，而與染料木素和維生素D₃單組相比，聯(lián)合組中MMP9mRNA的表達(dá)顯著降低，并且當(dāng)濃度增加時(shí)，抑制作用減弱。如圖8e、8f所示，染料木素對(duì)破骨細(xì)胞中組織蛋白酶KmRNA的表達(dá)有明顯的抑制作用，但在6.25～50.00μmol/L的濃度下，維生素D₃卻顯著促進(jìn)了組織蛋白酶K的表達(dá)。所以，染料木素逆轉(zhuǎn)了維生素D₃對(duì)組織蛋白酶KmRNA表達(dá)的促進(jìn)作用，使聯(lián)合組對(duì)其表達(dá)量明顯降低。

3 結(jié)論

試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示染料木素和維生素D₃聯(lián)合使用比單獨(dú)用藥對(duì)成骨細(xì)胞的增殖具有顯著的促進(jìn)作用，同時(shí)也對(duì)破骨細(xì)胞有顯著的抑制作用。證實(shí)染料木素和維生素D₃對(duì)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和抑制破骨細(xì)胞增殖具有協(xié)同作用。維生素D₃與染料木素聯(lián)合用藥作用于MG-63細(xì)胞，ALP活性明顯增強(qiáng)，說(shuō)明二者聯(lián)合能促進(jìn)成骨細(xì)胞的早期分化，與文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的黃酮促進(jìn)成骨細(xì)胞分化一致。通過(guò)10%的CPC將鈣結(jié)節(jié)量化，得出聯(lián)合用藥能促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)的生成，促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化。本文還測(cè)定了OPG、RANKLmRNA的相對(duì)表達(dá)量，并比較了不同濃度不同組的OPG/RANKL比值。發(fā)現(xiàn)維生素D₃和染料木素聯(lián)合可能是通過(guò)OPG/RANKL/RANK通路促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟，有待進(jìn)一步研究。

本文通過(guò)對(duì)破骨細(xì)胞TRAP活性檢測(cè)以及TRAP、MMP9、組織蛋白酶KmRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)維生素D₃和染料木素聯(lián)合用藥能抑制破骨細(xì)胞的分化成熟。維生素D₃在6.25～50.00μmol/L，可顯著促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟和組織蛋白酶K的表達(dá)，同時(shí)顯著抑制破骨細(xì)胞成熟的標(biāo)記因子MMP9的表達(dá)。維生素D₃和染料木素的組合可顯著抑制破骨細(xì)胞的增殖和分化，染料木素在試驗(yàn)劑量?jī)?nèi)逆轉(zhuǎn)了維生素D₃對(duì)破骨細(xì)胞的促進(jìn)作用。

本文證實(shí)，染料木素可增強(qiáng)成骨細(xì)胞MG-63的增殖和分化，從而促進(jìn)抗骨質(zhì)疏松作用。有趣的是，高劑量的維生素D₃可促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖成熟從而促進(jìn)骨質(zhì)疏松作用，但是在維生素D₃和染料木素聯(lián)合使用時(shí)，這種作用可以逆轉(zhuǎn)，抗骨質(zhì)疏松作用也很明顯。染料木素和維生素D₃在抗骨質(zhì)疏松癥上的協(xié)同作用提供了一種新穎而有效的組合，在骨質(zhì)疏松癥的飲食療法中具有應(yīng)用的潛力。

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