作為中國(guó)“四大名醋”之一的山西老陳醋，其采用傳統(tǒng)自然固體發(fā)酵并結(jié)合獨(dú)特熏、淋、曬等工藝，形成老陳醋獨(dú)特的酸、綿、香、甜風(fēng)味與口感。老陳醋的獨(dú)特風(fēng)味得益于微生物菌群的生長(zhǎng)和代謝以及復(fù)雜的協(xié)同作用，產(chǎn)生豐富的香味物質(zhì)，除霉菌、酵母菌、乳酸菌、醋酸菌外，芽孢菌也是山西老陳醋發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的重要微生物種群，它在老陳醋風(fēng)味和功能成分的形成中起到重要作用。

芽孢桿菌是一類數(shù)量眾多的細(xì)菌，需氧或兼性厭氧，桿狀，革蘭氏陽(yáng)性，能夠在某些條件下形成內(nèi)生孢子。國(guó)內(nèi)外關(guān)于芽孢桿菌的研究已有多年歷史，對(duì)于芽孢桿菌的形態(tài)觀察、分類鑒定、生理機(jī)制、功能發(fā)掘以及生物防治等方面的研究已相當(dāng)透徹。2016年，王進(jìn)龍從山西老陳醋中分離出的芽孢菌有：解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamy-loliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheni-formis）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus）、萎縮芽孢桿菌（Bacillusatrophaeus）、巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）。

芽孢菌在陳醋釀造中起著重要的作用。乙偶姻是山西老陳醋重要功能成分川穹嗪的前體物質(zhì)，而芽孢菌產(chǎn)乙偶姻的能力比乳酸菌、醋酸菌更強(qiáng)、更穩(wěn)定。國(guó)內(nèi)外相關(guān)產(chǎn)乙偶姻菌種的篩選、育種、發(fā)酵工作也大都集中于芽孢菌。2015年，高文睿等從涼州熏醋中篩選出高產(chǎn)乙偶姻的芽孢菌Y4，產(chǎn)量為2.376mg/mL；2013年，張顯采用傳統(tǒng)誘變方法對(duì)枯草芽孢桿菌JNA3-10進(jìn)行復(fù)合誘變，獲得1株2，3-丁二醇脫氫酶（BDH）缺失型乙偶姻高產(chǎn)突變株JNA-UD-6，消耗150g/L葡萄糖，得到53.9g/L的乙偶姻和6.5g/L的2，3-丁二醇；2017年，Li等通過(guò)改變2，3-丁二醇的轉(zhuǎn)化策略，提高了地衣芽孢桿菌乙偶姻的產(chǎn)量。芽孢菌在陳醋中除對(duì)產(chǎn)乙偶姻有重要貢獻(xiàn)外，還產(chǎn)生多酚類物質(zhì)，從而賦予山西老陳醋抗氧化的功能。2014年，郇阿梅等從四川傳統(tǒng)麩醋醋醅中篩選出1株芽孢菌YB-32，培養(yǎng)24h后產(chǎn)生的總酚含量為263.6μg/mL。另外，芽孢菌還可產(chǎn)不揮發(fā)性酸，緩解山西老陳醋中乙酸的強(qiáng)烈刺激性酸味，使醋的口感更柔和醇厚。芽孢菌的代謝產(chǎn)物與發(fā)酵體系中的其它物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，生成一些風(fēng)味物質(zhì)，如乳酸乙酯、乙酸乙酯、檸檬酸乙酯、二羥基丙酮等，這些物質(zhì)可以很好地改善食醋風(fēng)味。在白酒產(chǎn)業(yè)中，關(guān)于產(chǎn)香芽孢菌的篩選和應(yīng)用積累了大量的研究資料，而在陳醋研究中鮮有關(guān)于產(chǎn)香芽孢菌的篩選和應(yīng)用方面的報(bào)道。

醋酸菌和乳酸菌是山西老陳醋醋酸發(fā)酵階段的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群。醋酸菌是陳醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中的主要菌種，可以通過(guò)乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶催化反應(yīng)將醇代謝為酸。目前，陳醋釀造中常用的醋酸菌有奧爾蘭醋桿菌（Acetobacterorleanense）、許氏醋桿菌（Acetobacterschuegenbachii）、彎曲醋桿菌（Acetobactercurvum）、紋膜醋桿菌（Aceto-bacteraceti）、惡臭醋酸桿菌（Acetobacterran-cens）、攀膜醋桿菌（Acetobacterascendans）、膠膜醋桿菌（Acetobacterxylinum）等。醋酸菌在釀醋過(guò)程中除產(chǎn)酸外，還產(chǎn)乙偶姻（川穹嗪前體物質(zhì)）等功能性物質(zhì)。Dai等報(bào)道了1株漢氏醋桿菌（acetobacterhansenii）產(chǎn)乙偶姻量達(dá)8.93g/L。在醋酸發(fā)酵階段中除醋酸菌產(chǎn)酸外，乳酸菌也可產(chǎn)生乳酸等不揮發(fā)性酸，減緩由總酸含量引起的刺激味道，使酸味更柔和、醇厚。此外，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸及其它不揮發(fā)性酸與醇類物質(zhì)生成乳酸乙酯等各種酯類物質(zhì)，也可豐富山西老陳醋的風(fēng)味和香氣。

微生物之間的互相作用可以增加其代謝物和功能物質(zhì)的含量。關(guān)于芽孢菌間的互作研究主要集中在白酒大曲的強(qiáng)化。2011年，楊濤等將5株嗜熱芽孢桿菌、3株酵母菌及1組復(fù)合產(chǎn)酸菌應(yīng)用于醬香白酒生產(chǎn)中，使得香味基酒的比例增加，并且白酒中的己酸和己酸乙酯含量也顯著提高；2017年，莊孝杰等從醬香型酒醅中篩選出具有優(yōu)良特性的拜耳接合酵母，研究其與地衣芽孢桿菌的互作，結(jié)果表明地衣芽孢桿菌促進(jìn)了拜耳接合酵母的乙醇轉(zhuǎn)化率，共培養(yǎng)體系中風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量也受到很大影響。2015年，吉晉波對(duì)分離自鎮(zhèn)江香醋醋醅的8株乳酸菌及2株醋酸菌的相互作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明醋醅中醋酸菌與乳酸菌穩(wěn)定共存，并對(duì)比分析了二者純培養(yǎng)及共培養(yǎng)發(fā)酵液中風(fēng)味化合物的差異。

本文從山西老陳醋釀造過(guò)程中分離的54株芽孢菌中，篩選出2株發(fā)酵性狀優(yōu)良的芽孢桿菌菌株，研究了這兩株芽孢菌之間，及與醋酸菌和乳酸菌間的相互作用，考察了其在純培養(yǎng)和不同比例共培養(yǎng)條件下對(duì)生物量、乙偶姻、多酚、總酯、不揮發(fā)性酸、有機(jī)酸和揮發(fā)性香氣成分的影響，為將來(lái)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)山西老陳醋釀造復(fù)配直投式發(fā)酵劑進(jìn)行了重要的基礎(chǔ)研究和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

醋醅取自醋廠醋酸發(fā)酵0，1，3，5，7，9，11d的醋醅。巴氏醋桿菌33、植物乳桿菌19為實(shí)驗(yàn)室前期篩選的優(yōu)勢(shì)優(yōu)良菌株，保存至山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與工程學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS培養(yǎng)基，青島高科園海博生物科技有限公司；模擬醋醅培養(yǎng)基，山西老陳醋醋廠醋酸發(fā)酵第2天的醋醅，即為模擬醋醅培養(yǎng)基；醋酸菌培養(yǎng)基：酵母10g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，pH7.0，121℃高壓蒸汽滅菌20min，滅菌后加4%無(wú)水乙醇。細(xì)菌DNA提取試劑盒，北京博邁德基因科技有限公司；PCR引物，由深圳華大基因公司合成；MakerD、MIX，上海生工生物工程有限公司；福林試劑、肌酸（均為分析純），北京索萊寶科技有限公司；草酸、丙酮酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸（均為色譜純），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 主要儀器、設(shè)備

T100型PCR儀、UniversialHoodⅡ型凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一儀器廠；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；戴安U3000液相色譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；Trace1300氣相色譜儀，TraceISQ質(zhì)譜分析儀；5417R型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 山西老陳醋源芽孢菌的分離和鑒定

在無(wú)菌、常溫條件下，將25g樣品加入內(nèi)置玻璃珠的225mL無(wú)菌生理鹽水中，140r/min振蕩培養(yǎng)20min，使其混勻；然后梯度稀釋，選取10^-5，10^-6，10^-73個(gè)梯度，涂布于MRS瓊脂平板培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2d。選取菌落數(shù)在30～300的平板，挑取其上表面粗糙、菌落形態(tài)較大的單個(gè)菌落涂片和革蘭氏染色，在電子顯微鏡（1000×）下觀察菌株細(xì)胞形態(tài)和拍照。對(duì)鏡檢結(jié)果為革蘭氏陽(yáng)性、有芽孢的桿狀菌株用試劑盒提取其基因組，16SrDNA測(cè)序比對(duì)，并用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。應(yīng)用的引物如下：上游：5′-CA-GATGGGAGCTTGCTCCCTG-3′；下游：5′-CGACTTCACCCAATCATCTG-3′。將鑒定結(jié)果為芽孢菌的，反復(fù)劃線于MRS平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，直至獲得純化的菌株，對(duì)其菌落拍照。

1.3.2 山西老陳醋源優(yōu)良芽孢菌的篩選

將54株已鑒定的芽孢菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h后，取菌株發(fā)酵液3mL，參照文獻(xiàn)、測(cè)定總酯含量及不揮發(fā)性酸含量。將發(fā)酵液8000r/min離心10min，取上清液1mL，采用福林-酚比色法測(cè)定多酚含量。取上清液3mL，采用O'Meara-比色法測(cè)定乙偶姻含量。

1.3.3 解淀粉芽孢桿菌1539與枯草芽孢桿菌803的相互作用研究

將篩選出的優(yōu)良芽孢菌株解淀粉芽孢桿菌1539與枯草芽孢桿菌803分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，菌體濃度均達(dá)到1×10⁶CFU/mL時(shí)，分別按照解淀粉芽孢桿菌1539與枯草芽孢桿菌803接種比例為1:0，0:1，1:0.1，1:0.5，1:1，1:5，1:10（V/V），總接種量為2%，加入30g醋醅模擬培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)6d。

1）生物量的測(cè)定

采用MRS培養(yǎng)基稀釋平板菌落法測(cè)定解淀粉芽孢桿菌1539與枯草芽孢桿菌803的生物量。

2）乙偶姻、多酚、總酯、不揮發(fā)性酸含量的測(cè)定

取10g上述培養(yǎng)6d的樣品，加入90mL蒸餾水浸泡30min，4000r/min離心10min，取上清液，采用上述1.3.2節(jié)方法，測(cè)定純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中芽孢菌的乙偶姻、多酚、總酯、不揮發(fā)性酸含量。

3）有機(jī)酸含量的測(cè)定

取5g上述培養(yǎng)6d的樣品，用超純水定容50mL，12000r/min離心5min，取上清液，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，采用外標(biāo)法測(cè)定草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸及琥珀酸等8種有機(jī)酸的含量，用He-mI和Simca軟件繪制有機(jī)酸的Heatmap圖和PCA圖。色譜測(cè)定條件為：液相系統(tǒng)UItimate3000；色譜柱C184.6mm×150mm，5μm；流動(dòng)相20mmol/LNaH2PO4，pH2.7；進(jìn)樣量20μL；流動(dòng)速度0.8mL/min；檢測(cè)器UV210nm；柱溫：室溫。

4）揮發(fā)性香氣種類和含量的測(cè)定

采用頂空固相微萃取方法萃取上述培養(yǎng)6d的1g樣品，用直接內(nèi)標(biāo)法測(cè)定其揮發(fā)性香氣的種類和含量，用HemI和Simca軟件繪制揮發(fā)性香氣的Heatmap圖和PCA圖。色譜條件：色譜柱為VF5MS（30mm×0.25×0.25mm），載氣為氦氣（純度99.999%），流量1mL/min，不分流。程序升溫：起始溫度40℃，保持3min，以4℃的速度升至160℃，保持1min，再以10℃/min的速度升至270℃保持5min。質(zhì)譜條件：接口溫度280℃，離子源溫度280℃，電子能量70eV，掃描質(zhì)量范圍41～500amu。

相關(guān)鏈接：丙酮酸，蘋果酸，乙偶姻，酒石酸

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