2、薄層色譜測(cè)定

(1)薄層板的制備：稱取4g硅膠G，加約10mL水于乳缽中研磨至糊狀，立即倒入涂布器內(nèi)，制成5cm×20cm、厚度O.3min的薄層板三塊，在空氣中干燥后，在105～110℃活化1h，取出放干燥器中保存。

(2)點(diǎn)樣：取兩塊薄層板，在距薄層板下端2.5cm的基線上用微量注射器滴加兩個(gè)點(diǎn)。在距板左邊緣1.7cm處滴加0TA標(biāo)準(zhǔn)溶液8μL(濃度O.5μg／mL)，在距板左邊緣2.5cm處滴加樣液25μL，然后在第二塊板的樣液點(diǎn)上加滴0TA標(biāo)準(zhǔn)溶液8μL(濃度O.5μg/mL)。

(3)展開(kāi)

①展開(kāi)劑

橫展劑：乙醚或乙醚-甲醇-水(94+5+1)。

縱展劑：甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(6+3+1.2+O.06)或甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6+3+1.4)，苯-冰乙酸(9+1)。

②橫向展開(kāi)：在展開(kāi)槽內(nèi)倒入10mL橫展劑，先將薄層板縱展至離原點(diǎn)2～3cm，取出通風(fēng)揮發(fā)溶劑l～2 min后，再將該薄層板靠標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的長(zhǎng)邊置于同一展開(kāi)槽內(nèi)的溶劑中橫展，如橫展劑不夠，可添加適量，展至板端過(guò)1min，取出通風(fēng)揮發(fā)溶劑2～3min。

③縱向展開(kāi)：在另一展開(kāi)槽內(nèi)倒入lOmL縱展劑，將經(jīng)橫展后的薄層板縱展至前沿距原點(diǎn)13～15cm。取出，通風(fēng)揮干至板面無(wú)酸味(約5～10min)。

(4)觀察與評(píng)定：將薄層色譜板置波長(zhǎng)365nm紫外光燈下觀察。

①在紫外光燈下將兩板相互比較，若第二塊板的樣液點(diǎn)在OTA標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)處出現(xiàn)最低檢出量，而在第一塊板相同位置上未出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則樣品中的OTA含量在測(cè)定方法的靈敏度10μg/kg以下。

②如果第一板樣液點(diǎn)在與第二板樣液點(diǎn)相同位置上出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則看第二板樣液的熒光點(diǎn)是否與滴加的標(biāo)準(zhǔn)熒光點(diǎn)重疊，再進(jìn)行以下的定量與確證試驗(yàn)。

(5)稀釋定量

比較樣液中OTA與標(biāo)準(zhǔn)OTA的熒光強(qiáng)度，估計(jì)稀釋倍數(shù)。經(jīng)稀釋后測(cè)定含量時(shí)，可在樣液點(diǎn)的左邊基線上滴加二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，0TA的量可為4ng、8ng。比較樣液與兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)OTA熒光點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，概略定量。

(6)確證試驗(yàn)：用碳酸氫鈉乙醇溶液(在100mL水中溶解6.0g碳酸氫鈉，加20mL乙醇)噴灑薄層色譜板，在室溫下干燥，于長(zhǎng)波紫外光燈下觀察，這時(shí)OTA熒光點(diǎn)應(yīng)由黃綠色變?yōu)樗{(lán)色，而且熒光強(qiáng)度有所增加，再估計(jì)樣品中OTA，如果與噴灑前情況不一致，要利用噴灑前所做的估計(jì)。

(六)注意事項(xiàng)

1、空氣濕度影響薄層板分離效果，可根據(jù)板面分離情況決定縱展劑中是否加水。

2、如果將薄層板直接進(jìn)行橫展，當(dāng)樣品中OTA含量高時(shí)，OTA的熒光點(diǎn)會(huì)被橫向拉長(zhǎng)，使點(diǎn)變扁，或分成兩個(gè)黃綠色熒光點(diǎn)。這是因?yàn)樵跈M展過(guò)程中原點(diǎn)上樣品的量超過(guò)了硅膠的吸附能力，原點(diǎn)上的雜質(zhì)和殘留溶劑在橫展中將OTA點(diǎn)橫向拉長(zhǎng)了，這時(shí)可根據(jù)OTA黃綠色熒光的總強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)熒光強(qiáng)度比較，估計(jì)需減少的滴加微升數(shù)或所需稀釋倍數(shù)。在本方法中，先將薄層板縱展一短距離后再橫展，避免了上述現(xiàn)象的發(fā)生。

3、OTA的標(biāo)準(zhǔn)使用液應(yīng)避光，用黑紙遮光。

4、在薄層板上OTA的最低檢出量為4μg，本方法的最低檢測(cè)量為10μg/kg。

5、本方法經(jīng)五個(gè)協(xié)作者驗(yàn)證，當(dāng)小麥、玉米中OTA加入量分別為10、50、100μg／kg水平、每個(gè)水平n=2時(shí)，方法的回收率用X表示，精密度用SD表示：

小麥分別為93±10.23、92±14.72、105±38.85；

玉米分別為88±9.68、88±9.68、103±41.2。

二、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

用赭曲霉毒素A作為半抗原，與牛血清白蛋白(BSA)或人γ球蛋白結(jié)合，制成復(fù)合抗原；免疫動(dòng)物，產(chǎn)生特異性的抗血清或單克隆抗體，并建立起酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法。Candlish等人1986年首次報(bào)道了抗赭曲霉毒素A的單克隆抗體。衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所也已制備出高特異性的抗赭曲霉毒素單克隆抗體，建立了直接競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(直接法)和間接競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(間接法)。

(一)直接法

1、原理：將已知抗原吸附在固相載體表面，洗除未吸附的抗原，加入一定量的酶標(biāo)記抗體與樣品(含有抗原)提取液的混合液，競(jìng)爭(zhēng)溫育后，在固相載體表面形成抗原-抗體-酶復(fù)合物。洗除多余部分，加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物發(fā)生降解反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。通過(guò)酶標(biāo)檢測(cè)儀，測(cè)出酶底物的降解量，從而推知被測(cè)樣品中的抗原量。

參考資料：食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)

相關(guān)鏈接：乙酸乙酯，碳酸氫鈉，赭曲霉毒素A