赭曲霉毒素(Ochratoxins)是由曲霉屬和青霉屬的幾個(gè)種產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物。在寒冷的氣候下，產(chǎn)毒霉菌主要是純綠青霉(P．uiridicatum)，而在溫暖的氣候下，產(chǎn)毒霉菌主要是赭曲霉(A.ochracatum)。赭曲霉毒素的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)是由異香豆素連接到p-苯基丙氨酸上的衍生物，有A、B、C、D四種化合物。赭曲霉毒素A(0chratoxin A．縮寫OTA)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

赭曲霉毒素B的分子結(jié)構(gòu)中沒有氯元素，赭曲霉毒素c是赭曲霉：葷素A的乙酯，赭曲霉毒素D是4-羥基赭曲霉毒素A。從對(duì)谷物的污染率、污染水平及對(duì)人畜的毒性考慮，OTA是重要的有衛(wèi)生學(xué)意義的霉菌代謝產(chǎn)物。OTA是穩(wěn)定的無色結(jié)晶化合物，溶于極性溶劑和稀碳酸氫鈉溶液，微溶于水。將0TA的乙醇溶液貯于冰箱中一年以上也無損失，但應(yīng)避光保存，如接觸紫外線，幾天就會(huì)分解。

OTA主要污染谷物和大豆，在動(dòng)物飼料中OTA的污染率和污染水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過供人食用的糧食。動(dòng)物食用污染OTA的飼料，OTA蓄積于動(dòng)物體內(nèi)，在動(dòng)物的腎、肝、肌肉和血液中都能檢出OTA，人也可通過食用動(dòng)物組織攝入OTA。OTA對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性主要表現(xiàn)為腎臟毒和肝臟毒，并有致畸和致癌作用。由OTA引起的天然發(fā)生的霉菌毒素病有丹麥和瑞典豬的霉菌毒素腎病，OTA也可能是巴爾干地區(qū)流行的人的地方性腎病的病因。世界糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)在第37次(1991年)報(bào)告中對(duì)OTA的毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，認(rèn)為豬是最敏感的動(dòng)物，腎是OTA作用的主要靶器官。應(yīng)用對(duì)豬進(jìn)行90d喂養(yǎng)試驗(yàn)的結(jié)果，評(píng)價(jià)人的OTA允許攝入量，用最低有作用水平每天0.0008 mg／kg體重和500倍的安全系數(shù)，在此基礎(chǔ)上建立了每星期112μg／kg體重的暫時(shí)允許攝入量。我國還沒有制定出OTA的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，食品(包括谷物、動(dòng)物組織)中OTA的檢測方法有薄層色譜法、高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫吸附測定法。

一、薄層色譜法

(一)適用范圍

本方法適用于小麥、玉米和大豆中OTA的測定。

(二)原理

用三氯甲烷-0.1mol/L磷酸或石油醚-甲醇/水提取樣品中的OTA，樣品提取液經(jīng)液-液分配后，根據(jù)其在波長365nm紫外光燈下產(chǎn)生黃綠色熒光，在薄層色譜板上與標(biāo)準(zhǔn)比較測定含量。

(三)試劑

以下試劑除特殊規(guī)定外均為分析純?cè)噭?，水為蒸餾水或同等純度的水。

1、石油醚(60～90⁰C或30～60℃)；

2、甲醇；

3、三氯甲烷；

4、甲苯；

5、乙酸乙酯；

6、甲酸；

7、冰乙酸；

8、乙醚；

9、苯-乙腈(98+2)；

10、0.1mol/L磷酸[c(H₃PO₄)=0.1mol/L]：稱取11.5g磷酸(85%磷酸)，加水稀釋至1000mL；

11、2mol/L鹽酸溶液[c(HCl)=2mol/L]：量取20mL鹽酸，加水稀釋至120mL；

12、4％氯化鈉溶液；

13、0.1mol/L碳酸氫鈉溶液[c(NaHCO₃)=0.1mol/L]：稱取8.4g碳酸氫鈉，加適量水溶解，并用水稀釋至1000mL；

14、硅膠G；

15、赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液：用苯-冰乙酸(99+1)配成40μg/mLOTA貯備液，并用紫外分光光度計(jì)測定其濃度。最大吸收峰波長333nm，分子量403，摩爾消光系數(shù)值為5550)。精密吸取貯備液，用苯稀釋成每毫升含OTAO.5μg。OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)置冰箱中避光保存。

(四)儀器

所有玻璃儀器均需用稀鹽酸浸泡，依次用自來水、蒸餾水沖洗。

1、小型粉碎機(jī)；

2、電動(dòng)振蕩器；

3、玻璃板：5cm×20cm；

4、薄層涂布器：0.3mm；

5、展開槽：內(nèi)長25cm，寬6cm，高4cm；

6、紫外光燈：波長365nm；

7、微量注射器：10μL，50μL；

8、具O.2mL尾管的10mL小濃縮瓶。

(五)操作步驟

1、樣品溶液的制備

甲法：稱取20g粉碎并通過20目篩的樣品，置于200mL具塞錐形瓶中，加入10O mL三氯甲烷和10mL O.1mol/L磷酸，振蕩30min后通過快速定性濾紙過濾。取20mL濾液置于250mL分液漏斗中，加50mL，0.1mol/L碳酸氫鈉溶液振搖2min，靜置分層后，將三氯甲烷層放入另一個(gè)100mL分液漏斗中(少量乳化層或即使三氯甲烷層全部乳化都可放入分液漏斗中)，加入50 mL0.1mol/L碳酸氫鈉溶液，重復(fù)提取三氯甲烷層，靜置分層后棄去三氯甲烷層(如三氯甲烷層仍乳化，棄去，不影響結(jié)果)。碳酸氫鈉水層并入第一個(gè)分液漏斗中，加約5.5 mL2 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH2～3(用pH試紙測試)，加入25mL三氯甲烷振搖2min，靜置分層后，放三氯甲烷層于另一盛有100mL水的250mL分液漏斗中，酸水層再用10mL三氯甲烷振搖提取、靜置，將三氯甲烷層并入同一分液漏斗中，振搖、靜置分層，用脫脂棉擦干分液漏斗下端，放三氯甲烷層于一75mL蒸發(fā)皿中，將蒸發(fā)皿置蒸氣浴上通風(fēng)揮干，用約8mL三氯甲烷分次將蒸發(fā)皿中的殘?jiān)芙?，轉(zhuǎn)入具尾管的10mL濃縮瓶中，置80tC水溶鍋上用蒸氣加熱吹氮?dú)鉂饪s至干，加入0.2mL苯-乙腈(98+2)溶解殘?jiān)?，搖勻，供薄層色譜點(diǎn)樣用。

乙法：稱取20g粉碎并通過20目篩的樣品，加于200mL具塞錐形瓶中，加30mL石油醚和100mL甲醇-水(55+45)，在瓶塞上抹一層水蓋嚴(yán)防漏。振蕩30min后，通過快速定性濾紙濾入分液漏斗中，待下層甲醇水層分清后，取出20mL濾液，置于100mL分液漏斗中，用pH試紙測試，一般為5～6。加入25mL三氯甲烷振搖2min，靜置分層后放出三氯甲烷層于另一個(gè)分液漏斗中，再用10mL三氯甲烷重復(fù)振搖提取甲醇水層(在用三氯甲烷振搖提取時(shí)，如發(fā)生乳化現(xiàn)象，可滴加甲醇促使其分層)，將三氯甲烷層合并于同一分液漏斗中，加入50～100mL4％氯化鈉溶液(加入量視品種不同而異，大豆加100mL，小麥、玉米則加50mL左右)，振搖放置(如為大豆樣品，還須輕輕反復(fù)倒轉(zhuǎn)分液漏斗，使乳化層逐漸上升。如乳化嚴(yán)重，可加入少許甲醇)，待三氯甲烷層澄清后，用脫脂棉擦干分液漏斗下端，放三氯甲烷層于75mL蒸發(fā)皿中(如為大豆樣品，須再加入10mL三氯甲烷振搖，三氯甲烷層合并于同一蒸發(fā)皿中)，將蒸發(fā)皿置蒸氣浴上通風(fēng)揮干。以下操作自“用約8mL三氯甲烷分次將蒸發(fā)皿中的殘?jiān)芙?rdquo;起，按甲法操作。

參考資料：食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)

相關(guān)鏈接：赭曲霉毒素A，赭曲霉毒素B，微量注射器