一、目的要求

1、人工合成色素的測(cè)定原理及方法。

2、理解和熟悉高效液相色譜儀的工作原理及操作要點(diǎn)。

3、掌握高效液相色譜技術(shù)測(cè)定人工合成色素的方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

食品中人工合成色素用聚酰胺吸附法或用液-液分配法提取，制成水溶液，注入高效液相色譜儀，經(jīng)反相色譜分離，根據(jù)保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行定性和定量。

三、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1、試劑

①甲醇：分析純，經(jīng)濾膜(FH 0.5μm)過(guò)濾。

②乙酸銨溶液：0.02mol/L。稱取1.54g乙酸銨，加水至1000mL，溶解，經(jīng)濾膜(HA 0.45μm)過(guò)濾。

③氨水(2+98)的0.02mol/L乙酸銨溶液：量取氨水(2+98)O.5mL，加0.02mol/L乙酸銨溶液至1000mL。

④聚酰胺粉：過(guò)200目。

⑤甲醇一甲酸溶液：6:4。量取甲醇60mL，甲酸40mL，混勻。

⑥檸檬酸溶液：200g/L。稱取20g檸檬酸，加水至100mL，振搖溶解。

⑦乙醇-氨水-水溶液：7:2:1。取無(wú)水乙醇70mL，氨水20mL，水10mL混勻。

⑧三正辛胺-正丁醇溶液：5:95。量取三正辛胺5mL，加正丁醇95mL，混勻。

⑨飽和硫酸鈉溶液。

⑩硫酸鈉溶液：20g/L。稱取20g硫酸鈉，溶解于1000mL蒸餾水中，振搖溶解。

?正己烷：分析純。

?pH=6水：在水中加200g／L檸檬酸調(diào)pH到6。

⑩著色劑標(biāo)準(zhǔn)溶液：檸檬黃、13落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、赤蘚紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)按其純度折算為100％質(zhì)量，配成1.00mg/mL的pH=6水溶液，臨用時(shí)加pH=6水稀釋成50.0μg/mL。經(jīng)濾膜(HA0.45μm)過(guò)濾。

2、儀器

高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

稱取20.0～40.0g橘子汁，放入100mL燒杯中。含二氧化碳的樣品加熱驅(qū)除二氧化碳。

2、色素提取

①聚酰胺吸附法：樣品溶液加200g／L檸檬酸調(diào)至pH=4，加熱至60⁰C，將lg聚酰胺粉加少許水調(diào)成糊狀，倒入樣品溶液中，攪拌片刻，以G3垂熔漏斗抽濾，用60⁰C的水(pH=4)洗滌3～5次，然后用甲醇一甲酸混合液洗滌3～5次(含赤蘚紅的樣品不能洗)，再用水洗至中。用乙醇-氨水-水混合液解吸3～5次，每次5mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸發(fā)至近干，加水溶解，定容至4mL。經(jīng)濾膜(HAO.45μm)過(guò)濾，取lOμL進(jìn)高效液相色譜儀。

②液-液分配法(適用于含赤蘚紅的樣品)：將制備好的樣品溶液放入分液漏斗中，加20mL鹽酸、三正辛胺-正丁醇溶液(5+95)10～20mL，振搖，提取，分取有機(jī)相。重復(fù)此操作，合并有機(jī)相，用飽和硫酸鈉溶液洗2次，每次10mL，分取有機(jī)相，放至蒸發(fā)皿中，水浴加熱濃縮至10mL，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入60mL正己烷，混勻。加氨水(2+98)提取2～3次，每次5mL。合并氨水層(含水溶性色素)，用正己烷洗2次，氨水層加乙酸調(diào)成中性，水浴加熱蒸發(fā)至近干，加水溶解，定容至5mL。經(jīng)濾膜(HA0.5μm)過(guò)濾，取lOμL進(jìn)高效液相色譜儀。

3、高效液相色譜條件

①色譜柱：YWG-C₁₈，4.6mm×250mm，10μm，不銹鋼柱。

②流動(dòng)相：甲醇：0.02mol／L的CH₃COONH₄溶液(pH=4)。

③梯度洗脫：甲醇20％～35％，3％/min；35％-98％，9％/min；98％繼續(xù)6min。

④流速：1mL/min。

⑤檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)254nm。

根據(jù)保留時(shí)間定性，外標(biāo)峰面積法定量。

五、注意事項(xiàng)

1、樣品在加入聚酰胺粉吸附色素之前，要用200g/L檸檬酸調(diào)至pH=4，因?yàn)榫埘０贩墼谄嵝?pH=4～6)條件下對(duì)色素的吸附能力較強(qiáng)，吸附較完全。

2、如果樣品色素濃度太高，要用水適當(dāng)稀釋，因?yàn)樵跐馊芤褐校剽c鹽的鈉離子不容易解離，不利于聚酰胺粉吸附。

3、樣液中的色素被聚酰胺粉吸附后，當(dāng)用熱水洗滌聚酰胺粉以便除去可溶性雜質(zhì)時(shí)，要求水偏酸性，防止吸附的色素被洗脫下來(lái)，使定量結(jié)果偏低。

4、在提純的樣品溶液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮時(shí)，要控制水浴溫度在70～80⁰C之間，使其緩慢蒸發(fā)，勿濺出皿外，另外要經(jīng)常搖動(dòng)蒸發(fā)皿，防止色素干結(jié)在蒸發(fā)皿的壁上。

參考資料：食品中有毒有害物質(zhì)檢測(cè)

相關(guān)鏈接：乙酸銨，聚酰胺粉，檸檬酸