γ-氨基丁酸(GABA)是一種四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，是由谷氨酸脫羧酶不可逆、專(zhuān)一地將L-谷氨酸的α-羧基脫去-分子CO₂得到，是高度溶于水的兩性離子，pK值為4.03和10.56，因此表現(xiàn)出與該類(lèi)氨基酸類(lèi)似的生理活性，即作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)存在于哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。目前廣泛應(yīng)用于工業(yè)、動(dòng)物飼料、醫(yī)藥和食品行業(yè)。

大量研究表明，GABA有促進(jìn)睡眠、增強(qiáng)記憶力、抗焦慮、預(yù)防和治療癲癇、延緩腦衰老、舒緩血管、調(diào)節(jié)激素分泌、提高受精率、解除氨毒、增強(qiáng)肝功能等作用。

目前制備GABA的方法主要有植物富集法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法、酶催化法。植物富集法生產(chǎn)GABA雖然安全環(huán)保，但GABA濃度低，尚無(wú)法用作藥物、食品添加劑；化學(xué)合成法生產(chǎn)GABA安全性較差、有化學(xué)殘留，也不易達(dá)到醫(yī)藥及食品行業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)：微生物發(fā)酵法得到的GABA是一個(gè)多相復(fù)雜體系，濃度低，下游產(chǎn)物分離成本高，是生產(chǎn)高純度、高濃度GABA的一個(gè)瓶頸問(wèn)題。所以，目前制備GABA多采用酶催化法，主要是利用微生物細(xì)胞內(nèi)分離得到的谷氨酸脫羧酶或能夠生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶的微生物細(xì)胞專(zhuān)一、不可逆地脫去L-谷氨酸的α-羧基，從而得到高濃度、高純度的GABA。此方法的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)條件溫和、不需要昂貴的原料、能耗低，并且微生物來(lái)源的谷氨酸脫羧酶和能夠生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶的微生物細(xì)胞可通過(guò)簡(jiǎn)單的細(xì)胞培養(yǎng)大量獲取。

目前大多研究以大腸桿菌為宿主表達(dá)GAD，催化生產(chǎn)GABA。在重組菌發(fā)酵過(guò)程中添加一定濃度的輔酶磷酸吡哆醛(PLP)能夠促進(jìn)GAD的折疊，從而提高GAD酶活力。除此之外，酶催化法即利用GAD將谷氨酸脫去一分子CO₂制備GABA過(guò)程中，在酶轉(zhuǎn)化體系中添加一定量的PLP可以促進(jìn)酶液或全細(xì)胞的轉(zhuǎn)化舊。有研究者報(bào)道了在大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中直接添加0.02mmol/LPLP后，GABA產(chǎn)量是對(duì)照的2.0～2.5倍。但是PLP價(jià)格昂貴，在發(fā)酵過(guò)程和酶轉(zhuǎn)化體系中直接添加無(wú)疑大大增加生產(chǎn)成本。由于大腸桿菌自身具備吡哆醛激酶(PdxK)基因和磷酸吡哆醇氧化酶(PdxH)基因，從而形成PLP補(bǔ)救途徑(見(jiàn)圖1)。輔酶前體吡哆醇(PN)、吡哆胺(PM)和吡哆醛(PL)上57羥甲基通過(guò)PdxK使其磷酸化，生成對(duì)應(yīng)的輔酶中問(wèn)體磷酸吡哆醇(PNP)和磷酸吡哆胺(PMP)以及輔酶磷酸吡哆醛(PLP)，PdxH進(jìn)一步催化PNP或PMP的氧化反應(yīng)，生成輔酶PLP，輔酶PLP的增加可促進(jìn)GAD的折疊，提高GAD酶活力。黃燕等研究了在大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中添加PN后，酶活是對(duì)照組(不添加PN)的1.8倍。

但是大腸桿菌為非食品安全菌株，在發(fā)酵過(guò)程中易產(chǎn)生內(nèi)毒素，并且需要添加價(jià)格昂貴且有毒害作用的IPTG作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)產(chǎn)酶，其生產(chǎn)得到的GAD安全性不高，距離滿(mǎn)足食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的要求還有一定差距?？莶菅挎邨U菌是通過(guò)美國(guó)食品和藥物管理局GARS認(rèn)證的安全菌株，廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥生產(chǎn)中。然而在枯草芽孢桿菌中缺少PdxH，所以無(wú)法利用添加輔酶前體PN的方式，通過(guò)PLP補(bǔ)救途徑將PN轉(zhuǎn)化為PLP，從而提高GAD酶活力。目前，大量的研究集中在以枯草芽孢桿菌為宿主生產(chǎn)GAD，在酶轉(zhuǎn)化過(guò)程中通過(guò)直接添加輔酶PLP提高轉(zhuǎn)化效率，如丁偉等運(yùn)用安全宿主枯草芽孢桿菌生產(chǎn)GABA，在其轉(zhuǎn)化過(guò)程巾直接添加PLP，全細(xì)胞催化GABA產(chǎn)量為239.91g/L，轉(zhuǎn)化率54.48％。由于PLP價(jià)格昂貴，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高，無(wú)法適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)需求。關(guān)于在枯草芽孢桿菌為宿主生產(chǎn)GAD發(fā)酵過(guò)程中，添加價(jià)格低廉的輔酶前體以提高GAD酶活力的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此作者以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)為宿主，通過(guò)基因工程將大腸桿菌來(lái)源的谷氨酸脫羧酶基因(gadB)在B.sMbtilis中異源表達(dá)，添加相對(duì)廉價(jià)的輔酶前體PL，通過(guò)PdxK介導(dǎo)的PLP補(bǔ)救途徑將其轉(zhuǎn)化生成PLP(見(jiàn)圖2)，從而提高酶活和產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

質(zhì)粒EcoliJMl09/pET-24a(+)-gadB為作者所在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，菌株B.5Mbtilis和表達(dá)載體pHY300PLK(含啟動(dòng)子P_HfpaH和P_armyQ，不含信號(hào)肽)由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：分別稱(chēng)取氯化鈉10g、酵母粉5g、蛋白胨10g，溶于1L去離子水中，并通過(guò)添加2mol/LNaOH或HCl調(diào)節(jié)pH至7.0。

LB固體瓊脂培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為20g/L的瓊脂粉。

高滲液體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基巾添加0.5mol/L山梨醇。

電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中分別添加0.5mol/L山梨醇和甘露醇，質(zhì)量濃度為100g/L的葡萄糖。

RM培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中添加0.5mol/L山梨醇和0.38mol/L甘露醇。

TB培養(yǎng)基(g/L)：分別稱(chēng)取酵母粉24g、蛋白胨12g、甘油5g、三水磷酸氫二鉀16.43g、磷酸二氫鉀2.31g，溶于1L去離子水中，并添加2mol/LNaOH或HCl調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.1.3 試劑

pH至7.0。1.1.3試劑QuickcutHindⅢ限制性?xún)?nèi)切酶：購(gòu)自TaKaRa生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；2xphantaMaxMasterMix、ExnaseⅡ無(wú)縫連接試劑盒：購(gòu)自諾唯贊(南京)生物科技有限公司；DL-10000DNAMarker、氨芐青霉素、四環(huán)素：購(gòu)白寶生物有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA同收試劑盒：購(gòu)白天根生化科技(北京)有限公司

UnstainedProteinMWMarker標(biāo)準(zhǔn)蛋白品、蛋白膠制備試劑盒：購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司：分子級(jí)的蛋白胨和酵母粉：購(gòu)自英國(guó)Oxiod公司：其他常規(guī)試劑：購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 主要儀器

PCR儀：購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司：722型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：購(gòu)白上海儀電分析儀器有限公司：冷凍式離心機(jī)：購(gòu)自Beckmancoulter公司：KQ-250E型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司；pH計(jì)：購(gòu)自瑞士Mettler-Toledo公司：高效液相色譜儀：購(gòu)自安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

以質(zhì)粒pET-24a(+)-gadB為模板，根據(jù)無(wú)縫克隆同源臂設(shè)計(jì)原則分別設(shè)計(jì)正、反向引物：正向弓I物(F1)：57-GGAGTGTCAAGAATGGACCAGAAGCTGTTAACGGA-3'：反向引物(R1)：5'-‘ITTATTACCAAGCTTTCAGGTGTGTTTAAAGCTGTTC-3’。

以質(zhì)粒載體pHY300PLK為模板，根據(jù)無(wú)縫克隆同源臂設(shè)計(jì)原則分別設(shè)計(jì)正、反向引物：
正向引物(F2)：5'-TCAAATAAGGAGTGTCAAGAATG-3’：反向引物(R2)：5’-GGTGTTTTTTTACCAAGCTT-3’。
將設(shè)計(jì)好的引物送至蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 目的基因和表達(dá)載體的獲取

以實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒pET-24a(+)-gadB為模板，F(xiàn)1/R1為正反向引物擴(kuò)增gadB目的基因；PCR反應(yīng)體系(50μL)：5×PSBuffer10μL、ddH₂034μL、dNTP4μL、模板DNA0.5μL，正、反向引物各0.5μL，PrimerSTARPolymerase0.5μL。

PCR程序：94℃預(yù)變性5min，98℃變性10S，55℃退火5S。72℃延伸2min，變性至延伸過(guò)程進(jìn)行29個(gè)循環(huán)：72℃延伸10min；4℃保存。

以質(zhì)粒載體pHY300PLK為模板，F(xiàn)2/R2為正反向引物擴(kuò)增表達(dá)載體；PCR反應(yīng)體系(50μL)：5×PSBuffer10μL、ddH₂O34μL、dNTP4μL、模板DNA0.5μL,正、反向引物各0.5μL，PrimerSTARPolymerase0.5μL。

PCR程序：94℃預(yù)變性5min，98℃變性10s，55℃退火5S，72℃延伸6min，變性至延伸過(guò)程進(jìn)行29個(gè)循環(huán)：72℃延伸10min；4℃保存。

目的基因和表達(dá)載體PCR條帶通過(guò)瓊脂糖核酸電泳進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 目的基因和表達(dá)載體的連接與鑒定

1.2.2已驗(yàn)證正確的PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠同收試劑盒進(jìn)行回收?；厥蘸蟮腜CR產(chǎn)物用ExnaseⅡ連接酶連接，其連接體系如下：ddH₂O5.3μL、5×CEBuffer2μL、ExnaseⅡ1μL、表達(dá)載體1.16μL、目的基因0.54μL，置于PCR儀37℃反應(yīng)30min完成連接。

采用大腸桿菌JMl09熱擊轉(zhuǎn)化法后，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞液涂布至含100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)10～12h，挑取單菌落至含100μg/mL氨芐青霉素的10mLLB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床37℃、200r/min培養(yǎng)8～10h后收集菌體，并提取質(zhì)粒以便驗(yàn)證和進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將提取的質(zhì)粒進(jìn)行HindⅢ酶切驗(yàn)證正確后送往蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的質(zhì)粒通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入表達(dá)宿主B.Subtilis中，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞液涂布至含20μg/mL四環(huán)素的LB同體培養(yǎng)基上，在37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)10～12h，挑取單菌落至含20μg/mL四環(huán)素的10mLLB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床37℃、200r/min培養(yǎng)8～10h后收集菌體，并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

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