②標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：采用內(nèi)標(biāo)法定量。把一定量的維生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚及內(nèi)標(biāo)苯并[e]芘溶液混合均勻。選擇合適靈敏度，使上述物質(zhì)的各峰高約為滿量程70％，為高濃度點(diǎn)。高濃度的1/2為低濃度點(diǎn)(其內(nèi)標(biāo)苯并[P]芘的濃度值不變)，用此種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行色譜分析，結(jié)果見(jiàn)色譜圖。維生素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制是以維生素峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，維生素濃度為橫坐標(biāo)繪制，或計(jì)算回歸方程。如有微處理機(jī)裝置，則按儀器說(shuō)明用兩點(diǎn)內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

不能將δ-生育酚和γ-生育酚分開(kāi)，所以γ-生育酚峰中包含有β-生育酚峰。

(3)高效液相色譜分析：色譜條件(參考條件)如下。

①預(yù)柱：ultrasphere ODS 10μm，4mm×4.5cm。

②分析柱：ultrasphere ODS 5μm，4.6mm×25cm。

③流動(dòng)相：甲醇+水=98+2，混勻，臨用前脫氣。

④紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：300nm，量程0.02。

⑤進(jìn)樣量：20μL。

⑥流速：1.7mL/min。

(4)試樣分析取試樣濃縮液20μL，待繪制出色譜圖及色譜參數(shù)后，再進(jìn)行定性和定量。

①定性：用標(biāo)準(zhǔn)物色譜峰的保留時(shí)間定性。

②定量：根據(jù)色譜圖求出某種維生素峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，以此值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到其含量，或用回歸方程求出其含量。

5、計(jì)算

式中：X——維生素的含量，mg/100g；

c——由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到某種維生素含量，μg/mL；

V——試樣濃縮定容體積，mL；

m——試樣質(zhì)量，g。

計(jì)算結(jié)果表示到三位有效數(shù)字。

6、說(shuō)明及注意事項(xiàng)

本方法為GB/T 5009.82—2003標(biāo)準(zhǔn)第一法。

本方法檢出限分別為：維生素A：0.8ng；α-生育酚：91.8ng；γ-生育酚：36.6ng；δ-生育酚20.6ng。

(二)維生素D的測(cè)定——三氯化銻比色法：(AOAC法)

1、原理

維生素D在三氯甲烷溶液中，與三氯化銻結(jié)合生成一種橙黃色化合物，顏色的深淺與維生素D的濃度成正比，在500nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值。

2、儀器

①可見(jiàn)/紫外分光光度計(jì)。

②分離柱。

3、試劑

①三氯化銻(250g/L)-三氯甲烷溶液：將25g干燥的三氯化銻迅速投入裝有100mL三氯甲烷的棕色試劑瓶中，振搖，使之溶解，再加入無(wú)水硫酸鈉10g。用時(shí)吸取上層清液。

②三氯化銻-三氯甲烷-乙酰氯溶液：在上述試劑①中加入為其體積3％的乙酰氯，搖勻。

③無(wú)水乙醚：不含過(guò)氧化物，檢查方法與處理方法同維生素A和維生素E測(cè)定。

④無(wú)水乙醇：不含醛類物質(zhì)，檢查方法與處理方法同維生素A和維生素E測(cè)定。

⑤石油醚(沸程30～60℃)：重蒸。

⑥維生素D標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取0.25g維生素D，用三氯甲烷稀釋至100mL，此液濃度為2.5mg/mL。臨用時(shí)以三氯甲烷配制成0.025～2.5μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

⑦乙二醇(PEG)600。

⑧白色硅藻土：Celite545(柱色譜載體)。

⑨氨水。

⑩無(wú)水硫酸鈉。

?氫氧化鉀溶液(0.5mol/L)。

?中性氧化鋁：色譜用，100～200目。在550℃灰化爐中活化5.5h，降溫至300ºC左右，取出裝瓶。冷卻后，每100g氧化鋁加入4mL水，用力振搖，使無(wú)塊狀，瓶口封緊儲(chǔ)存于干燥器內(nèi)，16h后使用。

4、操作方法

(1)試樣處理：皂化與提取同維生素A和維生素E的方法，如果試樣中有維生素A共存，可用以下方法進(jìn)行分離純化。

①分離柱的制備：取一支內(nèi)徑為2.2cm，具有活塞和砂芯板的玻璃色譜柱。第一層：加入1～2g無(wú)水硫酸鈉，鋪平整。第二層：稱取15g Celite545置于250mL碘價(jià)瓶中，加入80mL石油醚，振搖2min，再加入10mL聚乙二醇(PEG)600，劇烈振搖10min，使其黏合均勻，然后傾入色譜柱內(nèi)。第三層：加5g中性氧化鋁。第四層：加入2～4g無(wú)水硫酸鈉。輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)色譜柱，使第二層的高度保持在12cm左右。

②純化：先用30～50mL石油醚淋洗分離柱，然后將試樣提取液倒入柱內(nèi)，再用石油醚繼續(xù)淋洗。棄去最初收集的lOmL濾液，再用200mL容量瓶收集淋洗液至刻度。淋洗速度保持2～3mL/min。將淋洗液移入500mL分液漏斗中，每次加100～150mL水，洗滌3次(去除殘留的聚乙二醇600，以免與三氯化銻作用形成渾濁物，影響比色)，將上述石油醚層通過(guò)無(wú)水硫酸鈉脫水后，置于濃縮器中減壓濃縮至干或在水浴上用水泵減壓抽干，立即加入5mL三氯甲烷溶解備用。

(2)測(cè)定

①標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取維生素D標(biāo)準(zhǔn)使用液(濃度視試樣中維生素D含量高低而定)0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL于10mL容量瓶?jī)?nèi)，用三氯甲烷定容。取上述標(biāo)準(zhǔn)比色液各lmL于1cm比色皿中，立即加入三氯化銻-三氯甲烷-乙酰氯溶液3mL，在500nm波長(zhǎng)下，于2min內(nèi)測(cè)定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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