2.1.2 酵母菌的碳源同化試驗(yàn)結(jié)果

不同碳源對酵母菌的生長狀況有不同影響，本試驗(yàn)采用葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖、檸檬酸、殼聚糖、甘露醇、山梨糖醇、N-乙酰-D-氨基葡萄糖9種常用微生物培養(yǎng)基碳源試材，對大連傳統(tǒng)蝦醬中分離純化出的8株酵母菌進(jìn)行碳源同化試驗(yàn)，總結(jié)最適生長碳源，以及不同碳源對不同酵母菌的影響。

將8株酵母菌分別接種于9種碳源培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)時間相同的條件下，對不同培養(yǎng)基上的不同菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。根據(jù)形態(tài)學(xué)結(jié)果可以看出，從碳源角度來看，葡萄糖和蔗糖幾乎適應(yīng)所有酵母菌的生長，并且菌落生長很快，菌落旺盛；氨基葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和甘油作為碳源也可以使每種酵母菌生長，然而對不同種類的酵母菌的生長促進(jìn)情況不同，部分酵母菌生長速度較快且旺盛，部分酵母菌生長緩慢；殼聚糖培養(yǎng)基上沒有任何酵母菌的生長跡象。葡萄糖、蔗糖等是最常用的碳源，然而其來源通常采用淀粉水解等方式獲得。開發(fā)新的可利用碳源，如氨基葡萄糖可來源于甲殼素水解產(chǎn)物，甘油可來源于生物柴油加工廢棄物等，有助于拓寬微生物的碳源譜，以降低原料成本。

根據(jù)表2可以得出結(jié)論，對于這8株酵母，經(jīng)鑒定為膠紅酵母（Rhodotorulamucilaginosa）的菌株Y1、Y6，在以葡萄糖、蔗糖、甘油、甘露醇、山梨糖醇和氨基葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中均可正常生長，其中在葡萄糖和蔗糖培養(yǎng)基中生長情況最為良好，而在乳糖、殼聚糖和檸檬酸培養(yǎng)基中不能生長；Y2酵母菌株近平滑假絲酵母（Candidaparapsilosis）在除乳糖和殼聚糖以外的其它碳源培養(yǎng)基中均能正常生長，且在葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇和氨基葡萄糖培養(yǎng)基中生長情況最好；Y3和Y4已鑒定為同種酵母菌株龍貢毛孢子菌（Trichosporondomesticum），在除檸檬酸和殼聚糖以外的其它碳源下均能正常生長，其中在以葡萄糖、乳糖、蔗糖和氨基葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中生長情況最好；Y5、Y7和Y8已鑒定為同種酵母菌株漢斯德巴氏酵母菌（Debaryomyceshansenii），在除乳糖和殼聚糖以外的其它碳源下均能正常生長，在以葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇和氨基葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中生長情況最好。由表2可見，從傳統(tǒng)蝦醬中分離出的菌株，普遍具有能夠利用氨基葡萄糖的特性，這預(yù)示著這些菌株具有利用氨基葡萄糖作為碳源的潛質(zhì)。從這8種菌株碳源利用的分析可見，葡萄糖和蔗糖的碳源利用譜最廣，殼聚糖的碳源利用譜最窄。這些微生物的挖掘，可為之后開發(fā)蝦醬發(fā)酵劑奠定菌株基礎(chǔ)。

2.2 酵母菌DNA提取及26SrDNAPCR擴(kuò)增結(jié)果

以提取的8株酵母菌基因組為模板，采用通用引物26S1和26S2擴(kuò)增結(jié)果，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離和凝膠成像系統(tǒng)檢測結(jié)果如圖2所示，可以觀察到所有泳道的600bp左右位置均出現(xiàn)了一條清晰條帶且特異性強(qiáng)。將樣品中的PCR片段進(jìn)行回收純化后，送測序公司進(jìn)行測序。

2.2.1 蝦醬中26SrDNA序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的建立

測序結(jié)果利用BLAST工具，與NCBＩ數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性對比，比對結(jié)果如表3所示。由表3結(jié)果可知，菌株Y1與膠紅酵母FＪ009291.1同源性達(dá)到100%，菌株Y6與膠紅酵母FＪ515247.1同源性達(dá)到99%，可鑒定Y1、Y6為膠紅酵母；菌株Y2與近平滑假絲酵母EU605809.1同源性達(dá)到100%，可鑒定其為近平滑假絲酵母；菌株Y3、Y4與龍貢毛孢子菌ＪN939470.1同源性達(dá)到99%，可鑒定其為絲孢酵母（Trichosporondomesticum）；菌株Y5與漢遜德巴利酵母（Debaryomyceshansenii）ＪX649975.1同源性達(dá)到100%，菌株Y7、Y8與漢遜德巴利酵母LC219505.1同源性達(dá)到100%，可鑒定菌株Y5、Y7、Y8為漢遜德巴利酵母。

根據(jù)同源性分析結(jié)果，選擇同源性較高的不同參考菌株的序列，使用本地軟件Mega7.0，運(yùn)用Neighbor-Ｊoining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，菌株膠紅酵母FＪ009291.1與膠紅酵母FＪ515247.1在同一分支上，親緣關(guān)系最近，形成第1類群；菌株絲孢酵母ＪN939470.1形成第2類群；菌株近平滑假絲酵母EU605809.1形成第3類群；菌株漢遜德巴利酵母ＪX649975.1與漢遜德巴利酵母LC219505.1在同一分支上，親緣關(guān)系最近形成第4類群。所有分離株與相對應(yīng)的參考菌株同源性都在99%和100%，證明酵母菌26SrDNA序列分析結(jié)果準(zhǔn)確，置信度高。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)中分離并鑒定的酵母菌均被報(bào)道在發(fā)酵食品中與食物的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物產(chǎn)生互相作用，對發(fā)酵食品的風(fēng)味、口感、安全和營養(yǎng)方面等產(chǎn)生了有益作用。例如，Salgado等對葡萄酒中漢遜德巴利酵母產(chǎn)生揮發(fā)性化合物的研究表明，該酵母可產(chǎn)生對應(yīng)10類的揮發(fā)性化合物：萜烯、高級醇、C6醇、醛類、揮發(fā)性物酸、乙酸酯、乙酯、揮發(fā)性酚、硫化合物和烴等，這些化合物可使葡萄酒的香氣更加濃醇，對改善口感起到了作用。李亞莉等采用近平滑假絲酵母接菌普洱茶，結(jié)果表明，接菌的發(fā)酵茶樣中主要功能成分含量均較自然發(fā)酵茶葉中的含量高，具有傳統(tǒng)普洱茶的品質(zhì)風(fēng)味，且在香氣和滋味方面有自身的特點(diǎn)，滋味醇和、厚滑，香氣純正略帶乳香，說明近平滑假絲酵母對發(fā)酵普洱茶的風(fēng)味、口感等起到一定的改善作用。此外，還有研究表明，海洋膠紅酵母具有抗菌、抑霉等特點(diǎn)，可提高發(fā)酵食品的品質(zhì)，延長其食品保質(zhì)期。毛俊霞研究發(fā)現(xiàn)，膠紅酵母中富含多種氨基酸，而且天冬氨酸、谷氨酸、丙氨基酸的含量較高，粗蛋白的含量為37.8%±0.52%，且由于其自身產(chǎn)類胡蘿卜素等特點(diǎn)，賦予了食品抗氧化性及新的營養(yǎng)特性，具有提升營養(yǎng)價值的作用。本研究中發(fā)現(xiàn)的這些酵母，推測可能在蝦醬特殊氣味、營養(yǎng)等的形成方面具有重要作用，可促進(jìn)蝦醬中的蛋白質(zhì)分解形成氨基酸，增加其獨(dú)特鮮味，賦予蝦醬濃郁的口感；此外，還具有提高其營養(yǎng)價值的作用，可能對發(fā)酵食品保質(zhì)期的延長起到促進(jìn)作用。

碳源同化能力是判斷微生物利用不同碳源能力的指標(biāo)，是微生物進(jìn)行鑒定的生理生化指標(biāo)，將為鑒定微生物的輔助特征提供有益補(bǔ)充。本文研究發(fā)現(xiàn)，膠紅酵母對葡萄糖和蔗糖的利用能力較好，對甘油的利用率次之，不能利用乳糖和殼聚糖。毛俊霞的研究表明，發(fā)現(xiàn)在重慶不同果園土壤中分離的膠紅酵母對蔗糖、甘露醇和甘油的利用率比較高；李新玲等在自制酸駝乳中發(fā)現(xiàn)了1株膠紅酵母，其碳源同化試驗(yàn)也表明，膠紅酵母對蔗糖的利用程度較高。在蝦醬中發(fā)現(xiàn)的膠紅酵母的碳源同化能力與其他研究人員的結(jié)果類似。Rivas等在玉米芯中提取的漢遜德巴利酵母優(yōu)先利用葡萄糖，其次是木糖以及阿拉伯糖等；Koganti等發(fā)現(xiàn)，漢遜德巴利酵母可高效利用甘油，高選擇性地生產(chǎn)阿拉伯糖醇，產(chǎn)量達(dá)55%，說明甘油為漢遜德巴利酵母的優(yōu)良碳源，可能還對于代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)具有一定的選擇性。本研究也發(fā)現(xiàn)，漢遜德巴利酵母優(yōu)選葡萄糖、蔗糖及山梨糖醇，此外，該酵母對甘油的利用比較顯著。絲孢酵母和近平滑假絲酵母對碳源的選擇性也與文獻(xiàn)報(bào)道一致，張玉瑧等分離獲得的1株絲孢酵母對葡萄糖和蔗糖利用效果最好；Preziosi-Belloy等用近平滑假絲酵母菌發(fā)酵半纖維素糖，在葡萄糖質(zhì)量濃度和甘露糖質(zhì)量濃度分別為27g/L和6g/L時，可正常生長，當(dāng)高于此濃度時，受到抑制，因此可以看出，葡萄糖和甘露糖為近平滑假絲酵母的碳源。碳源利用程度是評價微生物特性的指標(biāo)，本試驗(yàn)結(jié)果將為今后篩選優(yōu)良的發(fā)酵菌株及發(fā)酵生產(chǎn)菌株碳源的選擇提供一定參考。

從傳統(tǒng)蝦醬中共分離出8株酵母菌，通過對該8株酵母菌的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，鑒定結(jié)果為2株膠紅酵母（Rhodotorulamucilaginosa），1株近平滑假絲酵母（Candidaparapsilosis），3株漢遜德巴利酵母（Debaryomyceshansenii），2株絲孢酵母（Trichosporondomesticum）。對8株酵母菌的碳源同化試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖和蔗糖為酵母菌生長的最優(yōu)碳源；氨基葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和甘油雖然可以使每種酵母菌生長，但利用程度不同；乳糖和檸檬酸只能促進(jìn)部分種類酵母菌生長；而殼聚糖不宜用作酵母菌生長的碳源。這些微生物的挖掘，可為今后開發(fā)蝦醬發(fā)酵劑奠定菌株基礎(chǔ)，同時，也對促進(jìn)蝦醬中微生物資源利用，篩選合適發(fā)酵劑，推動大連傳統(tǒng)蝦醬產(chǎn)業(yè)發(fā)展起到積極作用。

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