醬油因其味道鮮美、口感醇厚，成為人們餐桌飲食的重要調(diào)味品。目前，國內(nèi)外的醬油釀造工藝主要有低鹽固態(tài)工藝和高鹽稀態(tài)工藝兩種。低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝最初是為了改善無鹽固態(tài)發(fā)酵醬油的風味而提出的，此工藝具有發(fā)酵溫度高、能夠抑制雜菌、原料利用率高和生產(chǎn)穩(wěn)定的優(yōu)點，并且周期較短、易于大規(guī)模生產(chǎn)，是我國大部分醬油生產(chǎn)企業(yè)主要釆用的發(fā)酵工藝。但是相較于高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝，酶作用周期比較短，酯香味不足，生產(chǎn)的醬油以中低檔為主。

高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝是把原料經(jīng)過蒸煮或焙炒、制曲后與20%左右的鹽水混合成醬醪，經(jīng)過發(fā)酵制成醬油。該工藝雖然周期長、原料利用率低，但是后發(fā)酵充分、味醇香濃，是廠家生產(chǎn)高檔醬油的首選工藝。但是高鹽稀態(tài)醬油中較高的鹽濃度（18%～22%）存在引發(fā)高血壓、心血管等疾病的潛在危險，可能會影響人體健康。食品法典委員會（codexalimentariuscommission,CAC）建議將飲食中鹽的攝入量從9g/d減少到6g/d，世界衛(wèi)生組織（worldhealthorganization,WHO）和糧食及農(nóng)業(yè)組織（foodandagricultureorganization,FAO）建議每日鹽攝取量不超過5g/d。所以食用低鹽發(fā)酵醬油已成為一種趨勢，提高低鹽發(fā)酵醬油的品質(zhì)已成為行業(yè)內(nèi)亟待解決的問題。

醬油發(fā)酵是典型的混菌發(fā)酵過程，多種微生物參與其中并發(fā)揮作用，主要有曲霉、酵母菌、乳酸菌以及其他細菌，其中酵母菌和乳酸菌在醬油發(fā)酵過程中發(fā)揮重要作用。魯氏接合酵母（Zygosaccharomycesrouxii）、埃切假絲酵母（Candidaetchellsii）和易變球擬酵母（Torulopsisversatilis）與醬油發(fā)酵的關系最為密切，其中研究和應用最多的是魯氏接合酵母。魯氏接合酵母是醬醪中的優(yōu)勢微生物，主要作用于醬油發(fā)酵前期，除了能生成多種醇類，還能參與含硫化合物等風味物質(zhì)的形成，帶給醬油更加復雜和醇厚的香氣。目前，人工添加魯氏接合酵母的效果明顯、技術成熟，并受到了一致認可。

乳酸菌種類多、總量大，能夠發(fā)酵葡萄糖生成酸類物質(zhì)，是影響醬油發(fā)酵的重要微生物。嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcushalophilus）是一類參與醬油發(fā)酵的耐鹽乳酸菌。嗜鹽四聯(lián)球菌具有多種氨肽酶，能參與氨基酸的次級代謝和醇醛之間的轉(zhuǎn)化。在醬油生產(chǎn)過程中強化嗜鹽四聯(lián)球菌和酵母菌，能通過菌株間的協(xié)同作用使醬油風味更加豐富。已有研究表明，添加兩種酵母菌（Z.rouxii和皺狀假絲酵母（Candidaversatilis））和嗜鹽四聯(lián)球菌可使醬油中醇類、酯類、酸類和吡嗪類等物質(zhì)含量顯著增加，揮發(fā)性物質(zhì)總量提高2.2倍。嗜鹽四聯(lián)球菌對低鹽醬油防腐有著一定的積極意義，其能夠利用葡萄糖產(chǎn)生高濃度乳酸。乳酸不僅能賦予醬油柔和的酸味，而且醬油發(fā)酵過程中維持一定濃度的乳酸能有效抑制巨大芽胞桿菌（Bacillusmegatherium）為主的醬油變質(zhì)脹瓶污染菌，有利于成品醬油的質(zhì)量安全。另外，嗜鹽四聯(lián)球菌還能減少胺類危害物的含量。

研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌和乳酸菌在醬醪中存在通過物質(zhì)代謝產(chǎn)生的拮抗作用，乳酸菌和酵母菌的添加需要有一定的間隔期，并且其添加量對醬醪發(fā)酵也有顯著影響。本研究以通過模擬低鹽醬油快速發(fā)酵，在添加魯氏接合酵母的基礎上，考察嗜鹽四聯(lián)球菌不同添加量對醬醪理化指標、氨基酸和有機酸含量、揮發(fā)性風味物質(zhì)等的影響，揭示其發(fā)酵功能，為提高低鹽發(fā)酵醬油品質(zhì)提供理論參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

醬油曲精（米曲霉（Aspergillusoryzae）滬釀3.042）：久味食品科技有限公司；嗜鹽四聯(lián)球菌R44、魯氏接合酵母ZQ02：分離自新鮮醬醪，保存于本實驗室。

1.1.2培養(yǎng)基

嗜鹽四聯(lián)球菌培養(yǎng)基采用MRS肉湯培養(yǎng)基：英國Oxoid公司。使用時添加NaCl100g/L,pH7.0。固體培養(yǎng)基中添加瓊脂20g/L。

魯氏接合酵母培養(yǎng)基采用酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeastextractpeptonedextrose,YPD）：北京索寶來科技有限公司。使用時添加NaCl50g/L,pH5.0。固體培養(yǎng)基中添加瓊脂20g/L。

嗜鹽四聯(lián)球菌計數(shù)培養(yǎng)基采用MRS固體培養(yǎng)基：英國Oxoid公司。使用時添加納他霉素0.1g/L、NaCl100g/L,pH7.0。

酵母菌計數(shù)培養(yǎng)基[5]采用孟加拉紅固體培養(yǎng)基：青島寶博生物科技有限公司。使用時添加丙酸鈉5g/L、NaCl100g/L,pH5.0。

以上培養(yǎng)基均115℃滅菌30min。

1.1.3試劑

酵母膏、胰蛋白胨（均為生化試劑）：英國Oxoid公司；氨基酸標樣、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde,OPA）（色譜純）：美國Agilent公司；納他霉素（純度96%）：青島寶博生物科技有限公司。

1.2儀器與設備

867pH計、ME204電子天平：瑞士Mettler-Toledo公司；MultiskanFC酶標儀：美國賽默飛世爾科技有限公司；PegasusGC-HRT4D+氣相-高通量飛行時間質(zhì)譜儀：美國力可公司；UV-1240紫外可見分光光度計：日本島津公司；1260高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography,HPLC）儀：美國安捷倫公司。

1.3方法

1.3.1菌株培養(yǎng)

嗜鹽四聯(lián)球菌的培養(yǎng)：從甘油管中取適量嗜鹽四聯(lián)球菌菌液，接種至嗜鹽四聯(lián)球菌固體培養(yǎng)基，30℃活化培養(yǎng)5d。從活化平板上挑取單菌落接種到嗜鹽四聯(lián)球菌液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)60h，按1%(V/V）的接種量接種至嗜鹽四聯(lián)球菌液體培養(yǎng)基，30℃靜置培養(yǎng)至OD600nm值達到1.2（菌體濃度1.2×10⁸CFU/mL），備用。

魯氏接合酵母的培養(yǎng)：從甘油管中取適量魯氏接合酵母菌液，接種至魯氏接合酵母固體培養(yǎng)基，30℃活化培養(yǎng)2d。從活化平板上挑取單菌落接種到魯氏接合酵母液體培養(yǎng)基中，30℃、220r/min培養(yǎng)30h，按1%(V/V）的接種量接種至魯氏接合酵母液體培養(yǎng)基，30℃、220r/min培養(yǎng)至OD600nm值達到4.0（菌體濃度6.4×10⁷CFU/mL），備用。

1.3.2模擬低鹽醬油快速發(fā)酵工藝

制曲工藝：將黃豆粉和1.2倍的水混合均勻后在121℃下滅菌15min，冷卻至室溫后，把黃豆粉、炒熟的小麥粉（質(zhì)量比為6∶4）和醬油曲精（原料總質(zhì)量的1.5‰）充分拌勻。在生化培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)48h，適時翻曲，曲料表面長滿菌絲即為成曲。

發(fā)酵工藝：將成曲用研缽碾碎，與鹽水（100g/LNaCl）以體積比1.0∶2.5混合。將混合后的醬醪分裝入2L壇子中，30℃發(fā)酵30d，期間每天攪拌一次。在發(fā)酵第0、5、10、15、20、25和30天進行取樣。

菌株的添加方式及添加量：模擬低鹽醬油快速發(fā)酵過程菌株的添加方式及添加量見表1。發(fā)酵開始時（pH5.2左右）添加10⁷CFU/g魯氏接合酵母ZQ02(Z)。嗜鹽四聯(lián)球菌添加時間為發(fā)酵10d，添加量分別為10⁶CFU/g(Z+T(10））、10⁷CFU/g(Z+10×T(10））、10⁸CFU/g(Z+100×T(10））。

1.3.3嗜鹽四聯(lián)球菌和酵母菌數(shù)量的測定

采用平板計數(shù)法測定嗜鹽四聯(lián)球菌和酵母菌數(shù)量。稱取1g新鮮醬醪和99mL生理鹽水混勻，梯度稀釋后涂布到計數(shù)培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3～6d進行計數(shù)。嗜鹽四聯(lián)球菌為兼性厭氧菌，菌落較小，平板培養(yǎng)需要4～6d。因此，MRS平板計數(shù)時可以和醬醪中優(yōu)勢耐鹽細菌（包括魏斯氏菌（Weissella）、芽孢桿菌（Bacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus））區(qū)分。本方法所計算的酵母數(shù)量包括添加的魯氏接合酵母以及醬醪中的其他耐鹽酵母，后者與前者相比數(shù)量較少，可忽略不計。

1.3.4醬醪理化指標的測定

取100g醬醪，12000r/min離心30min，用孔徑為0.22μm的濾膜過濾上清液后進行測定。醬醪pH值采用精密pH計測定。總酸含量采用酸度計法測定。還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸法（3,5-dinitrosalicylicacid,DNS）測定。氨基酸態(tài)氮含量采用甲醛滴定法測定。

1.3.5醬醪游離氨基酸的測定

游離氨基酸采用高效液相色譜法測定，采用OPA進行柱內(nèi)衍生化，具體測定方法參照文獻。

1.3.6醬醪有機酸的測定

有機酸采用高效液相色譜法測定，具體方法參考文獻。

1.3.7醬醪揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

揮發(fā)性風味物質(zhì)采用頂空固相微萃?。╤eadspacesolidphasemicro-extraction,HS-SPME）聯(lián)合氣質(zhì)聯(lián)用技術（gaschromatography-massspectrometer,GC-MS）進行測定，具體方法參考文獻。測定后將樣品質(zhì)譜圖與美國國家標準與技術研究院（nationalinstituteofstandardsandtechnology,NIST)2.0標準譜庫比對鑒定，根據(jù)保留指數(shù)（retentionindex,RI）對揮發(fā)性物質(zhì)進行定性，根據(jù)內(nèi)標2-辛醇（83.36μg/L）的峰面積對揮發(fā)性物質(zhì)進行半定量分析。

1.3.8數(shù)據(jù)處理方法

利用Excel2012、SPSS19.0對數(shù)據(jù)進行處理分析，利用Origin8.5、R語言和AdobeillustratorCS6對數(shù)據(jù)可視化。所有試驗均重復3次，結(jié)果采用“均值±標準差”的形式展示。

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