隨著人們生活質量的提高和對食品營養(yǎng)保健功能認識的加強,我國食用植物油的需求不斷增加,油菜是我國重要的油料和經濟作物之一,菜籽油不僅富含人體所必需的氨基酸和脂肪酸,而且能較長時間地儲存,為了更好地滿足廣大人民對優(yōu)質食用植物油的需求,菜籽油品質改良已成為當前油菜育種領域的熱點。

菜籽油的主要成分是脂肪酸,油脂的優(yōu)劣由脂肪酸決定,而油脂脂肪酸的好壞則主要取決于其碳氫鏈飽和程度。脂肪酸根據碳氫鏈飽和與不飽和分為3類:飽和脂肪酸(主要有棕櫚酸、硬脂酸等)、單不飽和脂肪酸(油酸、芥酸等)和多不飽和脂肪酸(亞油酸、亞麻酸等),有研究表明,預防冠心病的指導方針集中在將飲食中的飽和脂肪和反式脂肪轉變?yōu)椴伙柡椭?飽和脂肪酸熔點較高,易凝固在血管壁上,從而導致高血壓和動脈粥樣硬化,且飽和脂肪酸還導致血膽固醇濃度上升,不飽和脂肪酸熔點較低,容易被人體吸收。

本研究以湖南省水稻油菜抗病重點實驗室前期對高亞麻酸甘藍型油菜(Brassicanapus)近等基因系進行的miRNA測序結果為基礎,篩選到的與脂肪酸代謝相關的bna-miR396及其靶基因乙酰轉移酶基因(Acetyltransferasegene,AT)。研究表明,AT通過催化乙?；鶊F從乙酰輔酶A(乙酰CoA,AcetylCoA)轉移到其作用底物芳香胺及雜環(huán)胺類物質上,參與脂肪酸轉化與降解,AT缺失會推遲植物開花時間并降低育性。利用同源基因克隆,得到AT基因的2個拷貝,分別構建過表達載體與干擾載體,轉化擬南芥,分析轉基因擬南芥后代種子脂肪酸組成,探究該基因在脂肪酸合成過程的功能,以期促進甘藍型油菜脂肪合成分子機理研究。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

高亞麻酸甘藍型油菜近等基因系（低亞麻酸株系575，亞麻酸含量為5.1%；高亞麻酸株系574，亞麻酸含量9.8%),野生型擬南芥(WT)由湖南農業(yè)大學國家油料改良中心提供。大腸桿菌感受態(tài)DH5α,限制性內切酶、dNTP、T4DNALigationKit購自北京擎科生物科技有限公司；pMD18-T載體由本實驗室保存；pCambia1300-35s-N1、pCambia1300-RNAi載體購于上?？殿伾锟萍加邢薰荆槐驹囼炛兴玫降囊锞杀本┣婵坪铣?。

1.2 AT基因克隆

利用數據庫進行檢索,發(fā)現AT基因有2個拷貝,分別在A基因組和C基因組,并以此序列(GSBRNA2T00114025001、GSBRNA2T00148464001)進行后續(xù)引物設計(表1),其中5′端酶切位點前的序列用于重組連接。

采用TransZolUP植物總RNA提取試劑盒(北京全式金)提取低亞麻酸甘藍型油菜株系575自交授粉后20～35d混合種子總RNA,并用TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix反轉錄試劑盒(北京全式金)合成cDNA第一鏈,以此為模板,進行PCR擴增,擴增體系包含KOD-FX聚合酶1μL,2×PCRBuffer25μL,dNTP(2.5μmol/L)10μL,正反向引物各0.2μmol/L,cDNA小于500ng,用ddH2O補足至50μL。反應條件為98℃2min預變性；98℃10s,60℃30s,68℃2min,35個循環(huán)；68℃7min延伸。

經PCR純化回收后，與pMD18-T載體相連，轉化到大腸桿菌中，由北京擎科公司進行測序。

1.3 生物信息學分析

用SnapGene3.2.1將克隆到的靶基因序列翻譯成氨基酸，經NCBI數據庫BlastP進行鑒定后,預測對應蛋白的一級結構,包括氨基酸組成、理化性質等；分別登錄PredictProtein、SOPMATMHMM網站進行蛋白亞細胞定位預測、結構預測、跨膜螺旋區(qū)分析；通過SWISS-MQPEL構建蛋白三級結構模型。

1.5 過表達載體與RNAi干擾載體構建

用BamHI和SalI雙酶切pCambia1300-35s-N1載體,膠回收，產物進行體外同源重組反應,獲得重組質粒。

用XbaI及BamHI雙酶切pCambial300-RNAi載體以及各個基因的RNAi片段的PCR產物,具體方法參考劉芳等,并進行改進,膠回收后進行連接,獲得重組質粒。測序檢驗正確后,用PstI和Sal.I雙酶切重組質粒及各個基因的RNAi片段的PCR產物,再次進行連接,轉化,獲得最終的RNAi載體。

將構建好的過表達載體與RNAi干擾載體轉入農桿菌中,以野生型擬南芥為受體,進行基因轉化,獲得T₀種子；用潮霉素篩選T₀擬南芥陽性苗并種植,之后，用PCR鑒定轉基因苗,收取得到T₁種子。

1.6 脂肪酸成分測定

采用SP-6890型氣相色譜儀、FID檢測器、N3000色譜工作站、毛細管色譜柱DB-23對轉基因擬南芥T₁種子進行脂肪酸成分測定,對7個主要的脂肪酸成分進行分析,測定時取5個轉基因后代株系,每個材料檢測約30粒種子。

2 結果與分析

2.1 靶基因與特異干擾片段克隆及檢測結果

以低亞麻酸甘藍型油菜20～35d自交種cDNA為模板,高保真擴增了乙酰轉移酶基因的2個拷貝,大小均為1350bp。分別對2個靶基因特異片段進行PCR高保真擴增,得到了目的片段長度大小的DNA片段。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 蛋白質一級結構預測與分析

以SnapGene3.2.1分別對AT基因翻譯出來的氨基酸序列,通過ExPASy-ProtParamtool進行理化性質分析表明(表3),AT基因的2個拷貝114與148氨基酸均為449個，分子量約50.5ku,114編碼的氨基酸偏中性而148編碼的蛋白偏堿性。不穩(wěn)定系數顯示114與148均為穩(wěn)定蛋白,且親水性較差，屬于脂溶性蛋白。

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