2.2 pDNA Listeria的均勻性

為了滿足核酸參考品的使用要求，依照方差分析法(F-檢驗(yàn)法)評(píng)價(jià)了pDNA的瓶內(nèi)和瓶間均勻性，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。制備的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)pDNA Listeria的瓶內(nèi)均勻性和瓶間均勻性統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表2。結(jié)果顯示，pDNA的性質(zhì)值在瓶內(nèi)和瓶間均質(zhì)性上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明該pDNA滿足qPCR的參考材料的均勻性要求。根據(jù)公式計(jì)算得出的均勻度不確定度為0.67μg/mL。

2.3 pDNA Listeria的穩(wěn)定性

在4、-20、-70、56℃的溫度下進(jìn)行了180天的短期穩(wěn)定性評(píng)估，并在56℃進(jìn)行了60天的極端溫度測(cè)驗(yàn)，結(jié)果表明pDNA Listeria降解不明顯(見表3)。采用線性模型作為pDNA的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行長期穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，通過12個(gè)月采樣結(jié)果建立單項(xiàng)線性回歸方程Y=β1+β0(β1為-0.017 58,β0為29.51),自由度為n-2和P=0.95(95%置信水平)的學(xué)生分布t-因子等于1.812,結(jié)果提示|β1|

2.4 pDNA Listeria定值

8個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室共同測(cè)定pDNA的屬性值，測(cè)量數(shù)據(jù)遵循正態(tài)分布，并且每個(gè)單元的測(cè)量數(shù)據(jù)的平均值的精度相等。8個(gè)實(shí)驗(yàn)室定值的平均值29.85μg/mL被認(rèn)為是pDNA Listeria的屬性值。pDNA定值過程帶來的的不確定度uq由統(tǒng)計(jì)公式(4)計(jì)算得出，定值引入的不確定度為0.22μg/mL。

2.5 pDNA Listeria綜合不確定性分析

質(zhì)粒DNA參考材料的不確定度包括由不均勻性引入的不確定度(uh)、長期保存穩(wěn)定性引入的不確定度(us)、定值過程中引入的不確定度(uq),綜合三種不確定度按照公式(5)計(jì)算參考物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，按公式(6)計(jì)算擴(kuò)展相對(duì)不確定度，結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)不確定度1.57μg/mL。擴(kuò)展不確定度為3.14μg/mL。

2.6 qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過梯度稀釋pDNA Listeria作為模板(106、105、104、103、102和101copy/mL)進(jìn)行qPCR分析。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，并根據(jù)循環(huán)閾值(Ct值)與模板濃度之間的關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖3)。各標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)如表4所示。在本研究中，所有靶基因的擴(kuò)增效率在94.3%～98.1%的范圍內(nèi)，且線性良好，表明合成基因片段可作為qPCR標(biāo)準(zhǔn)品，且qPCR核酸檢測(cè)參考品可用于單增李斯特菌的檢測(cè)。使用低至101copy/mL的模板濃度(每次9次重復(fù)反應(yīng)),可以在7次中檢測(cè)到全部3個(gè)基因。結(jié)果表明，所有qPCR檢測(cè)的LOD值(檢測(cè)下限)約為101copy/mL(見表4)。

2.7 pDNA Listeria和基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品的替代

使用了基因組標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)粒DNA參考材料梯度稀釋為模板繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，每條標(biāo)準(zhǔn)曲線重復(fù)6次。統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率和斜率(t檢驗(yàn))。結(jié)果證明，通過評(píng)估斜率和擴(kuò)增效率，在95%置信度下，基因組DNA建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線與pDNA Listeria建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表5。因此，可以使用pDNA Listeria代替基因組DNA來檢測(cè)單增李斯特菌。

3討論

傳統(tǒng)的基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通常為病原體基因組核酸提取物，但是由于需要檢測(cè)的靶標(biāo)序列在基因組中不能以均勻和量值可溯源的形式存在，因此在進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)的時(shí)候，靶標(biāo)序列和量值都難以溯源，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果難以進(jìn)行比較。因此亟需研制新型核酸參考材料。

人工DNA合成技術(shù)為參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備提出了新的可能，可以通過人工合成獲得完整的基因片段，甚至通過基因工程技術(shù)將多個(gè)目的基因串聯(lián)在同一個(gè)質(zhì)粒載體上，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多個(gè)檢測(cè)目的基因的檢測(cè)進(jìn)行質(zhì)量參考。

本研究中，根據(jù)李斯特菌檢測(cè)的需要，構(gòu)建了pDNA Listeria作為單增李斯特菌定性檢測(cè)和檢測(cè)性能評(píng)價(jià)的參考品。一個(gè)質(zhì)粒同時(shí)覆蓋hlyA、plcB、inlA 3種檢測(cè)目標(biāo)。檢測(cè)序列根據(jù)NCBI公布的hlyA、plcB、inlA序列人工合成，質(zhì)粒的濃度由不同的實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值確認(rèn)，因此在序列的準(zhǔn)確性和量值的可溯源性上，均可提供穩(wěn)定的保障。同時(shí)通過對(duì)pDNA Listeria進(jìn)行均勻度和穩(wěn)定性分析，顯示pDNA Listeria純度良好，均勻性、穩(wěn)定性滿足ISO指南35的相關(guān)要求。同時(shí)通過qPCR分析了pDNA Listeria在單增李斯特菌qPCR檢測(cè)中的應(yīng)用，結(jié)果顯示，使用pDNA Listeria制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性良好，可替代單增李斯特菌基因組DNA用于hlyA、plcB、inlA 3基因的PCR檢測(cè)的質(zhì)量參考。

因此，本研究研制的單增李斯特菌質(zhì)粒DNA參考物質(zhì)為單增李斯特菌hlyA、plcB、inlA基因PCR相關(guān)檢測(cè)提供了量值溯源的依據(jù)，為單增李斯特菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供了有力保障。質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有短期內(nèi)可大量復(fù)制、經(jīng)濟(jì)高效、量值準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn)，目前在單增李斯特菌檢測(cè)中，已見單獨(dú)使用hlyA基因制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的報(bào)道。在沙門菌檢測(cè)中，也有使用包含invA基因質(zhì)粒作為PCR檢測(cè)參考品的報(bào)道。但是將多種可用于鑒定和毒力分析的靶標(biāo)合成到一個(gè)質(zhì)粒中，實(shí)現(xiàn)一種參考品對(duì)多種檢測(cè)靶標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量參考的實(shí)踐尚未見報(bào)道。通過此項(xiàng)研究，希望該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在我國單增李斯特菌檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室能夠較好推廣應(yīng)用，能夠較好地提高單增李斯特菌檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室相關(guān)項(xiàng)目的檢測(cè)水平，保障各實(shí)驗(yàn)室測(cè)量結(jié)果的可比性、準(zhǔn)確性，為檢驗(yàn)結(jié)果的互認(rèn)和共享打下了良好的基礎(chǔ)，為預(yù)防由單增李斯特菌引發(fā)的大規(guī)模突發(fā)性公共安全事件進(jìn)行技術(shù)儲(chǔ)備。

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