一、免疫分析基礎(chǔ)

免疫分析(immunoassay，LA)是一種以抗原抗體特異性識(shí)別與可逆結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行定性分析和定量分析的技術(shù)。

與常規(guī)理化分析相比，免疫分析具有選擇性好、靈敏度高、分析容量大、簡便快捷、成本低、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，可大大簡化甚至省去樣品前處理過程，可檢測極性強(qiáng)、難揮發(fā)、具有同分異構(gòu)體的農(nóng)藥，不需要貴重儀器，對(duì)使用人員的專業(yè)技術(shù)要求不高，容易普及和推廣?；诿庖呋瘜W(xué)技術(shù)開發(fā)的免疫檢測試劑盒和檢測卡，可應(yīng)用于大量現(xiàn)場樣品的快速檢測。

20世紀(jì)90年代以來，農(nóng)藥、獸藥等小分子化合物免疫分析技術(shù)的研究和開發(fā)進(jìn)展迅速，在糧食、水果、蔬菜、茶葉、蜂蜜、肉、蛋、奶等農(nóng)副產(chǎn)品和水、土壤等環(huán)境樣品中農(nóng)藥、獸藥殘留物快速監(jiān)控方面發(fā)揮了重要作用。世界糧食與農(nóng)業(yè)組織(FAO)向許多國家推薦免疫分析技術(shù)，美國化學(xué)會(huì)將免疫分析、色譜分析(包括氣相色譜和高效液相色譜)共同列為農(nóng)藥殘留分析的主要技術(shù)，免疫檢測結(jié)果也被列入具有法律效力的證據(jù)，成為20世紀(jì)后期以來研究開發(fā)和應(yīng)用的熱點(diǎn)之一。

(一)抗原

抗原(antigen，Ag)是一類能誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物(抗體或效應(yīng)細(xì)胞)發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)?？乖詮?qiáng)的物質(zhì)多數(shù)是結(jié)構(gòu)較復(fù)雜、分子質(zhì)量大、具有異物性(抗原與所刺激的機(jī)體自身物質(zhì)的差異性)的物質(zhì)。病原微生物、組織、細(xì)胞、異源蛋白質(zhì)等多具備上述性質(zhì)，所以都是良好的抗原?？乖哂忻庖咴院头磻?yīng)原性兩種性質(zhì)。免疫原性是指抗原刺激機(jī)體后，誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生相應(yīng)抗體或效應(yīng)細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng)性。反應(yīng)原性是指抗原與免疫應(yīng)答產(chǎn)物抗體發(fā)生特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)性。

1、抗原的類型抗原根據(jù)所起的作用分為完全抗原和半抗原，根據(jù)來源和制備方法又可分為天然抗原和人工抗原，根據(jù)其與機(jī)體的親緣關(guān)系可分為同種異體抗原和自身抗原等。

(1)完全抗：原完全抗原(COF~@ete antigen)簡稱抗原，是一類既有免疫原性，又有反應(yīng)原性的物質(zhì)。大多數(shù)蛋白質(zhì)、細(xì)胞、病毒、細(xì)菌等都是完全抗原。

(2)半抗原：半抗原(hapten)是指具有反應(yīng)原性，但無免疫原性的物質(zhì)，又稱為不完全抗原。半抗原分為復(fù)雜半抗原和簡單半抗原。復(fù)雜半抗原(如大多數(shù)結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜的有機(jī)化合物等)不具有免疫原性，但具有反應(yīng)原性。簡單半抗原(如鏈烷等)既不具有免疫原性，又不具有反應(yīng)原性。

(3)天然抗原：天然抗原是指來自天然生物(如動(dòng)物、植物、微生物等)的抗原，這類抗原包括細(xì)胞、組織、蛋白質(zhì)、核酸、雜多糖、細(xì)菌、病毒等。天然抗原一般都是良好的完全抗原。

(4)人工抗原：人工抗原包括經(jīng)過人工化學(xué)修飾或改造的天然抗原、全合成人工抗原和以大分子為載體的人工抗原。為了研究免疫原性的化學(xué)基礎(chǔ)，可用已知化學(xué)基團(tuán)置換復(fù)雜天然抗原表面的特定基團(tuán)得到人工化學(xué)修飾或改造的天然抗原，如2，4-二硝基苯(DNP)修飾蛋白、碘化蛋白等。全合成抗原多為高分子聚合物，如由氨基酸聚合成的多肽等。相對(duì)分子質(zhì)量小于2 500的小分子一般不具備免疫原性，但可將小分子化合物與適當(dāng)大分子的載體(如蛋白質(zhì))共價(jià)耦聯(lián)制備人工抗原，免疫動(dòng)物獲得對(duì)相應(yīng)小分子化合物具有特異性識(shí)別能力的抗體。

(5)同種異體抗原：同種異體抗原(alloantigen)是指存在于人、同種動(dòng)物不同個(gè)體(同卵孿生者除外)的抗原性物質(zhì)。當(dāng)某個(gè)體的細(xì)胞或組織進(jìn)入另一個(gè)體時(shí)，可引起免疫應(yīng)答。人類血液中的紅細(xì)胞血型抗原和白細(xì)胞抗原均屬此類。

(6)自身抗原：自身抗原(autoantigen)是指引起自身免疫應(yīng)答的自身組織成分。一般自身組織對(duì)機(jī)體沒有免疫原性，但在外傷、感染、電離輻射、藥物等影響下，自身組織可以發(fā)生變性成為自身抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。自身抗原分為隱蔽的自身抗原和修飾的自身抗原。

2、影響免疫原性的因素

(1)異物性：抗原的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)差異越大、生物的種屬和親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，則免疫原性越強(qiáng)。如雞卵清蛋白對(duì)家禽是弱免疫原，而對(duì)羊、兔等動(dòng)物則是強(qiáng)免疫原。

(2)分子大?。嚎乖肿淤|(zhì)量越大其免疫原性越強(qiáng)。相對(duì)分子質(zhì)量大于10⁵的蛋白質(zhì)是較強(qiáng)的免疫原，相對(duì)分子質(zhì)量小于10⁵的物質(zhì)通常是弱免疫原。Young和Atassi(1986)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，免疫原性要求的最小多肽分子是由6個(gè)以上DNP賴氨酸組成的寡聚肽。在天然多肽中，目前已知能夠引起免疫應(yīng)答的最小分子是相對(duì)分子質(zhì)量為3 480的升血糖素。

(3)化學(xué)組成與結(jié)構(gòu)：除分子質(zhì)量外，抗原的免疫原性還取決于其化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)(包括化學(xué)基團(tuán)和構(gòu)象)。結(jié)構(gòu)越復(fù)雜的抗原，其免疫原性越強(qiáng)。比如雜多糖具有免疫原性，而纖維素、糖原、長鏈烷烴等雖然分子質(zhì)量大，但化學(xué)結(jié)構(gòu)比較簡單，則不具備免疫原性。有些抗原對(duì)酶、光、熱、氧、化學(xué)試劑等因子敏感，化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)(包括立體結(jié)構(gòu))易發(fā)生變化，其免疫原性也容易發(fā)生改變，蛋白質(zhì)變性后免疫原性會(huì)大大降低。

(4)物理狀態(tài)：顆?？乖?如病毒等)比溶解性抗原的免疫原性強(qiáng)，球狀蛋白比線狀蛋白免疫原性強(qiáng)。

3、農(nóng)藥人工抗原：農(nóng)藥、藥物等小分子化合物一般不具有免疫原性，但許多農(nóng)藥、藥物具有反應(yīng)原性。Landsteiner(1917)在小分子化合物免疫分析方面進(jìn)行了開創(chuàng)性研究工作，他將氨基苯磺酸重氮化后與蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基酚羥基鄰位結(jié)合，制備人工完全抗原，用該人工抗原免疫動(dòng)物，獲得了抗氨基苯磺酸抗體，在此基礎(chǔ)上建立了氨基苯磺酸的免疫分析方法。將目標(biāo)分析農(nóng)藥以半抗原的形式與分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)共價(jià)耦聯(lián)制備人工抗原，使農(nóng)藥分子突出于蛋白質(zhì)表面作為抗原決定簇，以人工抗原免疫動(dòng)物，誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗目標(biāo)分析農(nóng)藥的特異性抗體，在此基礎(chǔ)上建立對(duì)該農(nóng)藥具特異性識(shí)別能力的免疫分析方法。

事實(shí)上，并非所有農(nóng)藥半抗原與載體蛋白質(zhì)共價(jià)耦聯(lián)后免疫動(dòng)物，都能產(chǎn)生抗相應(yīng)農(nóng)藥的特異性抗體。如對(duì)酶、光、熱、氧、化學(xué)試劑等因子敏感的農(nóng)藥，在合成半抗原、制備人工抗原、免疫動(dòng)物制備抗體的過程中易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，難以獲得對(duì)這些農(nóng)藥具特異性親和力的抗體?？乖贵w反應(yīng)一般在水相中進(jìn)行，氫鍵和靜電引力是維系抗原抗體親和力的主要作用力之一。結(jié)構(gòu)簡單的鏈狀烷烴，疏水性強(qiáng)，即使其分子質(zhì)量大，與載體蛋白共價(jià)耦聯(lián)后免疫動(dòng)物，也難以獲得抗鏈狀烷烴的抗體。許多具有極性取代基、結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的農(nóng)藥(如取代雜環(huán)、取代芳香環(huán)類農(nóng)藥，甚至是含三元環(huán)的擬除蟲菊酯)半抗原共價(jià)結(jié)合在蛋白質(zhì)表面，成為特定的抗原決定簇，容易激活動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生對(duì)相應(yīng)農(nóng)藥具特異性親和力的抗體。而一些結(jié)構(gòu)簡單、分子質(zhì)量小的農(nóng)藥(如甲胺磷)，雖有一些免疫化學(xué)研究報(bào)道，但至今尚未真正獲得對(duì)甲胺磷具特異性親和力、能夠?qū)装妨走M(jìn)行高靈敏度檢測的實(shí)用性抗體。

(二)抗體

抗體(antihody)是免疫系統(tǒng)受抗原刺激后產(chǎn)生的能與抗原、半抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白。免疫球蛋白(immu：nogl()bulin，Ig)通常是一組具有抗體活性和抗體樣結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。免疫球蛋白普遍存在于脊椎動(dòng)物(包括人)的血液、組織和外分泌液中。所有抗體都是免疫球蛋白，但并非所有免疫球蛋白都是抗體，如骨髓瘤蛋白的結(jié)構(gòu)與抗體相似但無免疫學(xué)活性，具有免疫活性的免疫球蛋白才能稱為抗體。

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