一、目的和要求

①通過本實(shí)驗(yàn)加深對凱氏定氮法測定原理的認(rèn)識和理解。

②通過本實(shí)驗(yàn)掌握凱氏定氮法中樣品消化、蒸餾、吸收等技能的操作。

二、原理

本實(shí)驗(yàn)是利用蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物，當(dāng)食品與硫酸和催化劑一同加熱消化時(shí)，使蛋白質(zhì)分解，分解的氮與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后再堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，最后根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。

三、儀器

①500mL凱氏燒瓶。

②定氮蒸餾裝置。

四、試劑

①硫酸銅。

②硫酸鉀。

③硫酸。

④40g／L硼酸溶液。

⑤混合指示劑。

⑥400g／L氫氧化鈉溶液。

⑦0.1000mol／L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

五、實(shí)驗(yàn)步驟

1、樣品的消化

將黃豆粉碎，過40目篩，混勻后準(zhǔn)確稱取黃豆粉0.30g，小心移入lOOmL干燥的凱氏燒瓶中(勿黏附在瓶壁上)，加入0.2g硫酸銅、3g硫酸鉀及5mL硫酸(每克樣品加硫酸15mL)，稍搖勻后，將瓶以45^°斜支有石棉網(wǎng)的電爐上，先以小火緩慢加熱(沸騰的泡沫不超過瓶肚的2/3)，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強(qiáng)火力，并保持瓶內(nèi)液體微沸，直至液體呈藍(lán)色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5h，完成消化。

待消化液冷至室溫后，用蒸餾水干凈地轉(zhuǎn)入lOOmL容量瓶中，并用蒸餾水定容，搖勻，(消化液在臨用前再稀釋定容)。

2、蒸餾與吸收

連接好微量定氮蒸餾裝置，于水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水。檢查裝置的氣密性。

在接收瓶內(nèi)加入25mL 40g/L硼酸及2滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。準(zhǔn)確量取消化稀釋液lOmL經(jīng)漏斗口加入反應(yīng)管內(nèi)，用少量蒸餾水沖洗漏斗。經(jīng)漏斗再加入lOmL 40g/L氫氧化鈉溶液使其呈強(qiáng)堿性，立即夾好漏斗夾，并加少量水于進(jìn)樣漏斗中封口，以防漏氣。夾緊廢液排出口的螺旋夾，進(jìn)行水蒸氣蒸餾。蒸餾至冷凝管下端的吸收液變?yōu)榫G色開始計(jì)時(shí)，繼續(xù)蒸餾3min后，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管尖端后停止蒸餾。

3、滴定

吸收液用0.1000mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液出現(xiàn)微紅色在30s內(nèi)不消失即為達(dá)到滴定終點(diǎn)。

4、空白試驗(yàn)

不加試樣，按上述操作進(jìn)行空白試驗(yàn)。

六、結(jié)果處理   

式中：X——蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，％；

c——HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；

V₁——滴定樣品吸收液時(shí)消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；

V₂——滴定空白吸收液時(shí)消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；

V3——吸取消化液的體積,單位為毫升，mL ;

m——黃豆粉的質(zhì)量，g；

氮的摩爾質(zhì)量，14.01g/mol；

F——黃豆的蛋白質(zhì)含量換算系數(shù)(5.71)。

七、說明及注意事項(xiàng)

①消化過程應(yīng)注意轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，利用冷凝酸液將附著在瓶壁上的炭粒沖下，以促進(jìn)消化完全。

②樣品含脂肪或糖較多時(shí)，易產(chǎn)生泡沫，可加入少量辛醇或液體石蠟，或硅油消泡劑，防止其溢出瓶外，并注意適當(dāng)控制熱源強(qiáng)度。

③硫酸銅起到催化作用，加速氧化分解。同時(shí)也是蒸餾時(shí)樣品液堿化的指示劑，若所加堿量不足，分解液呈現(xiàn)藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，需再增加氫氧化鈉用量。

④蒸餾過程應(yīng)注意接口處有無松漏現(xiàn)象，蒸餾完畢，先將蒸餾出口離開液面，繼續(xù)蒸餾1min，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶內(nèi)，再將吸收瓶移開，最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸現(xiàn)象。

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