2.2 萃取溶劑對煙堿的影響

煙堿是強(qiáng)極性的有機(jī)物，易溶于水和甲醇，該試驗選取不同濃度的鹽酸、氫氧化鈉、氨水和甲醇考察不同溶劑的萃取效果（表2）。

由表2可知，不同濃度的甲醇溶液中煙堿含量總體高于氫氧化鈉溶液，與氨水和鹽酸萃取效果無顯著性差異。根據(jù)許燕娟等的研究結(jié)果，堿性溶液的強(qiáng)度對煙堿萃取率有較大影響，相同濃度下氨水溶液比氫氧化鈉溶液檢測到的生物堿種類多。類似地，Li等用不同濃度氨水萃取煙葉中的生物堿，發(fā)現(xiàn)6%氨水好于其它濃度，也好于氫氧化鈉溶液。綜合考慮到甲醇溶液相比氨水和鹽酸溶液有利于樣品溶液的儲存和液相色譜柱以及具有較好的抑菌性，因此，采用5%甲醇作為后續(xù)試驗的萃取溶劑。

2.3 萃取時間對煙堿萃取率的影響

超聲、微波等常用于輔助萃取試驗，然而它們在提高萃取率的同時，也會帶來更多雜質(zhì)，這對于采用紫外分光光度法檢測非常不利，因此，選擇較為溫和的常溫震蕩法進(jìn)行萃取。由表3中可以看出，隨著萃取時間的延長，萃取率升高，而在25、30 min時無顯著差異，為保險起見采用30 min作為萃取時間。

2.4 煙堿含量測定公式的探討與擬合

原公式以236和282 nm為梯形的中位線法推測雜質(zhì)在259 nm處的干擾。由圖1可以看出，由于雜質(zhì)的干擾，萃取液的紫外吸收谷底由煙堿的236 nm紅移至240～242 nm處，而與之等距離的是276～278 nm。但從圖1中可以看出，在波長小于278 nm時，4種類型樣品溶液的紫外吸光度與波長形成的斜率較大，為減小誤差而檢測279～282 nm處吸光度。因此，以240、259和282 nm的吸光度用于新公式的擬合。煙堿含量以HPLC法檢測結(jié)果為基準(zhǔn)。

從表4中吸光度與煙堿含量的相關(guān)性結(jié)果可以看出，煙堿含量與240 nm相關(guān)性接近顯著水平，這是因為煙堿在240 nm有紫外吸收，但又有雜質(zhì)干擾造成的；與259 nm處吸光度相關(guān)性達(dá)到顯著水平，這正是采用該方法原理所在。煙堿與282 nm處的吸光度相關(guān)性較差，這是因為煙堿在該處無吸收（圖1），其吸光度是因為雜質(zhì)的干擾。而樣品溶液在240、259和282 nm處的吸光度之間呈極顯著相關(guān)性，這恰好說明雜質(zhì)對這3個波長處的吸光度影響一致，這正是原公式建立的基礎(chǔ)。

以20個烤煙樣品在240、259和282 nm處的吸光度為自變量，以HPLC檢測煙堿含量為因變量用SPSS軟件擬合回歸得到擬合方程為：

C=（0.080 7+0.426 9×A259 + 0.473 9×A240 -0.631 2×A282）V/m

式中，C為煙堿含量/%，A259，A240和A282分別為樣品溶液的吸光度，V為樣品溶液體積/L，m為煙樣質(zhì)量/g。

再分別以2個公式對剩余57個煙葉樣品煙堿含量進(jìn)行計算，然后分別將計算結(jié)果除以HPLC檢測結(jié)果，則比值越接近1說明檢測越準(zhǔn)確。由圖3可以看出，全部樣品的原公式計算結(jié)果與HPLC檢測結(jié)果的比值基本呈正態(tài)分布，且在0.75～1.25的部分占49.12%；而烤煙樣品的比值在0.75～1.25的占55.88%，集中度略有提升；對于晾曬煙樣品，其比值也呈正態(tài)分布，但集中度較烤煙低，0.75～1.25的僅占39.13%。全部樣品的擬合公式計算結(jié)果與HPLC檢測結(jié)果的比值基本呈正態(tài)分布，0.75～1.25的占61.40%，高于原公式；烤煙樣品的比值在0.75～1.25的占76.47%，集中度有大幅提升；對于晾曬煙樣品其集中度較低，比值在0.75～1.25也是僅占39.13%，但是比值在0.5～0.75和1.25～1.60的分別由17.39%、21.74%提升至26.09%、30.43%?？梢钥闯觯?個公式的結(jié)果均是烤煙集中度高于晾曬煙，這是因為：1） 2種方法的建立基礎(chǔ)為烤煙，2） 晾曬煙的雜質(zhì)對吸光度的干擾有差別。

3 討論與結(jié)論

4種類型煙葉樣品的紫外掃描顯示，3種晾曬煙的圖形一致而與烤煙有差別，表現(xiàn)為峰谷比值前三者較為接近，以及吸收波長大于276 nm后的走勢呈緩慢下降而烤煙的紫外吸收幾乎不變，說明不同煙草類型的雜質(zhì)對吸收的影響有所差異。通過對不同萃取溶劑的考察發(fā)現(xiàn)，甲醇、鹽酸和氨水萃取效率較高，選擇甲醇作為萃取溶劑，是因為較好的抑菌性，并且有利于樣品溶液的保存以及對色譜柱友好。

原公式建立的基礎(chǔ)是朗伯比爾定律即煙堿含量與吸光度成正比。但是在實際測定過程中，由于檢測儀器等的誤差，標(biāo)準(zhǔn)曲線或者擬合曲線一般呈線性關(guān)系而非正比關(guān)系。另外，該試驗紫外掃描圖和文獻(xiàn)中均顯示煙堿在236 nm處有一定的紫外吸收，而不是無吸收，所以不能將236 nm處的吸光度全部作為雜質(zhì)。樣品溶液在240、259和282 nm處的吸光度之間存在極顯著相關(guān)性說明雜質(zhì)對這3處的吸光度影響較為一致，這正是2個公式建立的基礎(chǔ)。通過2個公式的計算結(jié)果與HPLC結(jié)果的比值分布可以發(fā)現(xiàn)，對于烤煙樣品，新擬合公式的精確度較原公式有大幅提升；而對于晾曬煙樣品則沒有明顯提升，這是因為2個公式的建立均是以烤煙為基礎(chǔ)而建立的，然而晾曬煙的雜質(zhì)與烤煙不一樣，這在紫外掃描圖中也有所反映。下一步將收集更多晾曬煙樣品，以建立更適用于它們的計算公式。

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