4、分析步驟

(1)試樣的制備

①谷物：在粉碎機(jī)中粉碎并通過(guò)廬2mm圓孔篩。

②啤酒：使用前先置于0～4℃冰箱冷藏1h，啟蓋，倒入錐形瓶中在振蕩器上振搖消泡。

(2)免疫親和柱色譜凈化高效液相色譜法(快速確證方法)

①提取

a．谷物(小麥、大麥、玉米)：準(zhǔn)確稱(chēng)取試樣50.0g(準(zhǔn)確到0.1g)于均質(zhì)器配置的攪拌杯中，加入5.0g氯化鈉，加入100mL甲醇+水(8+2)(V₁)。將攪拌杯置于均質(zhì)器上，于20000r／min高速攪拌提取1min。提取液經(jīng)槽紋折疊濾紙過(guò)濾于干凈的燒杯中。準(zhǔn)確移取10.0mL(V2)濾液并加入40.0mL水(V₂)稀釋?zhuān)旌暇鶆?，?jīng)玻璃纖維濾紙直接過(guò)濾入10mL注射器。

b．酒類(lèi)(啤酒、葡萄酒、黃酒)：準(zhǔn)確移取試樣10mL于100mL燒杯中，加入10mLl％聚乙二醇+5％碳酸氫鈉溶液(V₁總量應(yīng)為20mL)，用玻璃棒攪拌均勻。準(zhǔn)確移取10.0mL(V₂)經(jīng)玻璃纖維濾紙直接過(guò)濾入10mL注射器。

②凈化

a．谷物：將免疫親和柱連接于10mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取10.OmL(V₄)樣品提取液于玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器相連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過(guò)免疫親和柱，直至2～3mL空氣通過(guò)免疫親和柱。以10mL淋洗溶液、10mL水先后淋洗免疫親和柱，棄去全部流出液，并使2～3mL空氣通過(guò)免疫親和柱。準(zhǔn)確加入1.OmL(V)甲醇洗脫，流速為1～2mL/min。收集全部洗脫液于玻璃試管中。

b．酒類(lèi)：將免疫親和柱連接于10mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取10.0mL(V₄)樣品提取液于玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器相連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過(guò)免疫親和柱，直至2～3mL空氣通過(guò)免疫親和柱。以5mL淋洗溶液、5mL水先后淋洗免疫親和柱，棄去全部流出液，并使2～3mL空氣通過(guò)免疫親和柱。準(zhǔn)確加入1.0mL(V)甲醇洗脫，流速為1～2mL/min。收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測(cè)用。

③測(cè)定

a．高效液相色譜條件激發(fā)波長(zhǎng)360nm；發(fā)射波長(zhǎng)420nm。

色譜柱：C₁₈柱(柱長(zhǎng)150mm，內(nèi)徑3.0mm，填料直徑5μm)。

流動(dòng)相：乙腈-0.012mol/L磷酸鈉溶液。進(jìn)樣量：20μL。

b．操作：用微量注射器吸取20μL赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值(峰高或峰面積)，得到赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖。

用微量注射器吸取20μL樣品洗脫液注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定試樣的響應(yīng)值(峰高或峰面積)。經(jīng)過(guò)與赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖比較響應(yīng)值得到試樣中赭曲霉毒素A的濃度(c)。

④空白試驗(yàn)用水代替試樣，按上述步驟做空白試驗(yàn)。

⑤結(jié)果計(jì)算：樣品中赭曲霉毒素A的含量(X)以μg/kg表示，按式1計(jì)算：

其中：

式中：X₁——樣品中赭曲霉毒素A的含量，μg/kg；

c₁——試樣中赭曲霉毒素A的含量，μg/L；

c_o——空白試驗(yàn)中赭曲霉毒素A的含量，μg/L；

V——最終甲醇洗脫液體積，mL；

W——最終凈化洗脫液所含的試樣質(zhì)量，g；

m——試樣稱(chēng)取的質(zhì)量的數(shù)值，g；

V₁——樣品和提取液總體積，mL；

V₂——稀釋用樣品濾液體積，mL；

V₃——稀釋液體積，mL；

V₄——通過(guò)免疫親和柱的樣品提取液體積，mL。

⑥測(cè)定低限：免疫親和柱色譜凈化高效液相色譜法測(cè)定谷物、酒類(lèi)、藤蔓水果干、香辛料的低限均為1μg／kg(μg/L)。

(3)免疫親和柱色譜凈化熒光光度法(快速篩選方法)

①提取

a．谷物(小麥、大麥、玉米)同(2)①a。

b．酒類(lèi)(啤酒、白葡萄酒、黃酒)：準(zhǔn)確移取試樣50mL于均質(zhì)器配置的攪拌杯中，加入50mL 1％碳酸氫鈉溶液(V1總量應(yīng)為100mL)，以20000r/min高速攪拌提取1min，靜置。準(zhǔn)確移取10.0mL(V₂)并加入40.0mL純水(V₃)稀釋?zhuān)貌ＡЮw維濾紙直接過(guò)濾入10mL注射器。

②凈化

色谷物同(2)②a操作至“以10mL淋洗溶液、10mL水先后淋洗免疫親和柱，棄去全部流出液，并使2～3mL空氣通過(guò)免疫親和柱”為止。準(zhǔn)確加入1.5mL(V)洗脫溶液洗脫，流速為1～2mL／min。收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測(cè)用。

b．酒類(lèi)(啤酒、白葡萄酒、黃酒)：將免疫親和柱連接于10mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取10.0mL( V₄)樣品提取液于玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器相連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過(guò)免疫親和柱，直至2～3mL空氣通過(guò)免疫親和柱。以10mL淋洗溶液、10mL水先后淋洗免疫親和柱，棄去全部流出液，并使2～3mL空氣通過(guò)免疫親和柱。準(zhǔn)確加入1.5mL(V)洗脫溶液洗脫，流速為1～2mL/min。收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測(cè)用。

③測(cè)定：熒光光度計(jì)儀器條件激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)440nm。

熒光光度計(jì)校準(zhǔn)以0.05moL/L硫酸溶液為空白，調(diào)節(jié)熒光光度計(jì)的讀數(shù)值為0；以熒光光度計(jì)校準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)熒光光度計(jì)的讀數(shù)值為36。

樣液測(cè)定將洗脫液立即置于熒光光度計(jì)中讀取樣液中赭曲霉毒素A的濃度(c)。

④空白試驗(yàn)用水代替試樣，按上述步驟做空白試驗(yàn)。

⑤結(jié)果計(jì)算：                    

⑥測(cè)定低限：免疫親和柱色譜凈化高效液相色譜法測(cè)定谷物、酒類(lèi)、藤蔓水果干、香辛料的低限均為1μg／kg(μg/L)。

5、結(jié)果

(1)色譜圖：圖為赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖。

（2）濃度與響應(yīng)值的線性關(guān)系 赭曲霉毒素A系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜濃度與響應(yīng)值的線性關(guān)系

線性方程：y=3.185021x-0.075619(R=0.9999)

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相關(guān)鏈接：免疫親和柱，赭曲霉毒素A，碳酸氫鈉