引言

林可霉素為Streptomycinlincolnensis所發(fā)酵生產(chǎn)中廣效型抗生素，可以單獨(dú)使用或是與spetniomycin合并使用，以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)及改善飼料效率，對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌、霉?jié){菌及幽門桿菌均具有抗菌作用，常用于治療禽類及豬呼吸道感染癥或水產(chǎn)動(dòng)物鏈球菌感染，與紅霉素有拮抗作用，不可同時(shí)使用。

微生物檢測(cè)法是最早使用于檢測(cè)林可霉素的方法，但是其檢測(cè)的專一性與準(zhǔn)確度皆不理想，以儀器來(lái)分析林可霉素可得較準(zhǔn)確的結(jié)果。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)飼料中林可霉素檢驗(yàn)是以微生物方法為主，在消費(fèi)者對(duì)食品中動(dòng)物用藥品殘留愈來(lái)愈重視的今天，急需開發(fā)儀器定性定量的方法以避免爭(zhēng)議。故本研究以常見的氣相層析質(zhì)譜儀為檢測(cè)儀器，開發(fā)出高準(zhǔn)確度與高靈敏度的儀器分析方法。

1材料與方法

1.1儀器

安捷倫(Agilent)氣相層析儀系統(tǒng)，包括氣相層析儀(6890N)及質(zhì)譜儀(5973N)。日立(Hitachi)高效能液相層析系統(tǒng)包括幫浦(L7100)、自動(dòng)取樣器(L7200)、光二極管偵測(cè)器(L7450)、試管震蕩器(VortexGene2)、12孔吹氮器裝置(N-EVAP)、離心機(jī)(KN70)、純水系統(tǒng)(MillporeSynergy185)。

1.2試藥

林可霉素(lincomycin)及克林霉素(clindamycin)，分析級(jí)藥品，購(gòu)自Sigma-AldrichCo.(St.Louis，MO)；衍生試劑N-methyl-N(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(MSTFA)，購(gòu)自Sigma-AldrichCo.(St.Louis，MO)。甲醇(methanol)LC級(jí)藥品、冰醋酸(aceticAcid)、醋酸鋅(zinicacetatehydrate)及黃鐵鹽(potassiumhexcyanolerrate(Ⅱ)trihydrate)皆為試藥級(jí)，購(gòu)自MerckKGaA.(Darmstadt，Germany)；去離子水(18MΩ)經(jīng)由MillporeSynergy185純水系統(tǒng)處理。

1.3實(shí)驗(yàn)器具

15mL及50mLPP材質(zhì)(polypropylene)含蓋離心管，1.5mL及2mL微量試管，10mL及100mL定量瓶，J.T.Baker12孔固相萃取裝置，0.22μm孔徑PVDF材質(zhì)(polyvinylidenefluoride)針筒過(guò)濾膜，OASIShydrophilic-lipophilicbalance(HLB)材質(zhì)3mL60mg固相萃取匣。

1.4卡瑞試劑

1)卡瑞試劑Ⅰ，取21.9g醋酸鋅加入3mL冰醋酸以去離子水定量至100mL。

2)卡瑞試劑Ⅱ，取10.6g磺鐵鹽以去離子水定量至100mL。

1.5標(biāo)準(zhǔn)溶液與檢量線的制備

正確秤取林可霉素及克林霉素標(biāo)準(zhǔn)品10mg分別置于10mL定量瓶中，以甲醇溶解，并定量至10mL，為儲(chǔ)存溶液(stocksolution)。此儲(chǔ)存液溶含1000μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品并存放于2℃～8℃冰箱內(nèi)，不超過(guò)1個(gè)月。使用時(shí)將林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液以甲醇稀釋至濃度為10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL及0.625μg/mL，作為檢量線溶液。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品(internalstandard，IS)克林霉素則以甲醇稀釋至濃度為5μg/mL。取100μL各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液及5μg/mL內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于同一個(gè)玻璃樣品瓶中，以吹氮?dú)庋b置濃縮干燥后加入100μLMSTFA，再以鋁蓋密封后置于烘箱中以80℃加熱40min。

1.6固相萃取測(cè)試

將固相萃取匣裝置于固相萃取裝置中，預(yù)先以5mL甲醇及5mL去離子水平衡(condition)后，依序加入5mL10μg/mL的林可霉素溶液(溶于5%的甲醇溶液)、2mL去離子水、2mL5%甲醇溶液及5mL甲醇。分別收集此4部份沖提(eluted)樣品以HPLC檢測(cè)。

1.7樣品的配制

正確秤取飼料樣品5±0.01g，置于50mL離心管中，加入25mL5%的甲醇，再添加125μL1000g/mL克林霉素，振蕩10min后，以4000rpm離心5min，取上清液5mL于15mL的離心管中，加入0.5mL卡瑞試劑Ⅰ及0.5mL卡瑞試劑Ⅱ，振蕩混合后以4000rpm離心5min。通過(guò)以5mL甲醇及5mL去離子水潤(rùn)溼過(guò)的固相萃取管柱，以2mL去離子水沖洗，再以2mL5%甲醇洗凈后抽干5min，最后以5mL甲醇沖出。取0.1mL甲醇溶液以氮?dú)獯蹈?，再?.1mLMSTFA置于80℃烘箱反應(yīng)30min，即為待測(cè)樣品。

1.8分析條件

液相層析儀分析管柱為L(zhǎng)una250×4.6mmI.D.，粒徑為5μm，移動(dòng)相為0.01%磷酸：乙腈=88：12(v/v)，波長(zhǎng)設(shè)定為210nm，以50μL注入儀器分析。

氣相層析儀分析管柱為DB-5MS30m×0.25mmI.D.入口壓力13.2psi，He流速1mL/min，溫度條件為injector:300℃，升溫程序設(shè)定150℃恒溫1.5min，以20℃/min升溫至230℃再恒溫3min，以20℃/min升溫至300℃再恒溫5min。總分析時(shí)間為15.92min。以1μL注入分析，分析模式為不分流，以全掃描模式(SCAN)分析。

2結(jié)果與討論

林可霉素的分子量為406.54g/moL，pKa=7.6，易溶于甲醇。在固相萃取方面，本實(shí)驗(yàn)選擇了3種品牌的固相萃取匣測(cè)試，并在各萃取階段收集分析，因萃取液含有5%甲醇，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大部分C18固相萃取匣在5%甲醇環(huán)境下無(wú)法將林可霉素完全吸附。本實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行3d的測(cè)試，在添加10μg/g、5μg/g及1μg/g的濃度時(shí)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為9.13%、4.00%及13.60%。除了在添加1μg/g時(shí)的再現(xiàn)性超過(guò)10%，其余皆在10%以內(nèi)。依測(cè)試的結(jié)果來(lái)看，此分析方法的回收率平均為84%、重復(fù)性RSD%平均為7%與再現(xiàn)性RSD%平均為9%，與一般文獻(xiàn)中驗(yàn)證的結(jié)果差異不大，符合分析方法一般要求，因此可以應(yīng)用于飼料中林可霉素的檢驗(yàn)分析。

林可霉素的分析較少見到以GC/MS的分析方法，經(jīng)MSTFA衍生化后可以提高其特異性，有助于增加檢測(cè)感度。依實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，此方法具有良好的回收率、重復(fù)性與再現(xiàn)性，儀器一次分析時(shí)間約16min而且不需要復(fù)雜的前處理，定性定量方面皆優(yōu)于HPLC法，亦不須使用LC/MS/MS貴重儀器即能準(zhǔn)確的分析，故本方法可應(yīng)用于飼料中的殘留檢驗(yàn)。

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