1.2.4油茶提取物的制備及5α-R抑制活性的測(cè)定

1.2.4.1不同溶劑油茶葉提取物的制備及得率的計(jì)算

油茶葉去除病變經(jīng)過挑選，45℃烘箱干燥，粉碎過60目篩，稱取8份20g油茶葉粉末按1:40（w:v）料液比分別加入水、50%乙醇溶液、甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚，先攪拌浸泡3h再于50℃下超聲振蕩提取兩次（2h/次），4000r/min離心10min使得固液分離，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮除去有機(jī)試劑，然后真空冷凍干燥，得到不同極性溶劑的油茶粗提取物分別記為A1-~A8，觀察其顏色及性狀，并計(jì)算得率，計(jì)算公式如下：

得率%=100×m//M（4）

式中m為提取物的質(zhì)量（g），M為原料干基質(zhì)量（g）。

1.2.4.2油茶葉提取物5α-R抑制活性的測(cè)定

分別取A1~A8凍干粉末，用50%乙醇均配制成200μg/mL的稀釋液，按照1.2.2測(cè)定A1-A8稀釋液對(duì)5α-R的抑制率，以5α-R抑制率為指標(biāo)，確定最佳制備溶劑，并測(cè)定、計(jì)算最佳溶劑提取物對(duì)5α-R活性的半抑制濃度（IC50），相關(guān)計(jì)算公式同公式（3）。

1.2.5油茶提取物總酚和總黃酮含量的測(cè)定

用50%乙醇溶液將A1~A8配制成1mg/mL的稀釋液，采用Folin-Ciocalteu法，以沒食子酸計(jì)，測(cè)定不同油茶葉提取物中的總酚含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：配制梯度濃度的蘆丁溶液0~50μg/mL。在1mL體系中依次加入100μL沒食子酸溶液，250μL的福林酚試劑，250μL的15%的碳酸鈉溶液，再補(bǔ)足400μL水至1mL終體積。充分混合之后80℃水浴放置30min，靜置冷卻10min，4000r/min離心5min，取上清液于778nm測(cè)定吸光值A(chǔ)778。依據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和相應(yīng)的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的測(cè)定：操作同上，將樣品吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，以沒食子酸計(jì)，算得樣品總酚含量。

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法，以蘆丁計(jì)，測(cè)定不同溶劑植物提取物中總黃酮的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密配制梯度濃度的蘆丁溶液0~50μg/mL。吸取200μL待測(cè)蘆丁溶液，置于5mL試管中，加入300μL60%乙醇溶液，再加入100μL亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6min，加入150μL硝酸鋁溶液，搖勻，放置6min，加入400μL氫氧化鈉溶液，最后加入1.35mL60%乙醇溶液至終體系為2.5mL，搖勻，放置15min，于510nm測(cè)定吸光值A(chǔ)510。依據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和相應(yīng)的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的測(cè)定：操作同上，將樣品吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蘆丁計(jì)，算得樣品總黃酮含量。

1.2.6超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分析（UPLC-TRIPLETOF-MS/MS）分析鑒定油茶葉提取物的化學(xué)組分

參考王薇的方法取得8mg油茶葉50%乙醇提取物，加入2mL甲醇，配制成4mg/mL的提取物待測(cè)液，超聲5min后用0.22μm微孔濾膜過濾至液相瓶中，待測(cè)。

色譜柱：C18柱（2.1mm×150mm,1.8μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸-水溶液（流動(dòng)相A）和乙腈（流動(dòng)相B）；梯度洗脫條件：0~10min，5%~13%B；10~20min，13%B；20~40min，13%~20%B；40~60min，20%~45%B；60~70min，45%~100%B；進(jìn)樣量：10µL；流速：1mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm。

UPLC-TripleTOF5600+飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用儀：負(fù)離子掃描模式；掃描范圍：m/z100-2000；霧化氣（GS1）：55psi；霧化氣（GS2）：55psi；氣簾氣（CUR）：35psi；離子源溫度（TEM）：550℃（負(fù)）；離子源電壓（IS）：-4500V（負(fù)）；一級(jí)掃描：去簇電壓（DP）：100V；聚焦電壓（CE）：10V；二級(jí)掃描：使用TOFMS-ProductIon-IDA模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，CID能量為20、40和60V，進(jìn)樣前，用CDS泵做質(zhì)量軸校正，使質(zhì)量軸誤差小于2ppm。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（各組數(shù)據(jù)均用±s來表示）；用GraphpadPrism6.0繪制線圖、柱狀圖；相關(guān)性分析采用SPSS中Pearson相關(guān)性分析統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)（*P＜0.05）。

2結(jié)果與討論

2.15α-R粗酶提取物蛋白含量

粗酶提取物呈現(xiàn)粉紅色，采用Bradford法對(duì)5α-R粗酶提取物定量，以蛋白質(zhì)含量表示。測(cè)得蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.5753x+0.5269（y為吸光值，x為標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度，R2=0.9977），算得濃度為12.12mg/mL。

2.2T的標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖2所示，T在5μmol/L~2000μmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=18110x+116886（R²=0.9998）。

2.3酶促反應(yīng)體系的確定

如圖3所示，在0~2mmol/L范圍內(nèi)，隨著NADPH濃度的增加，酶活性不斷上升，當(dāng)NADPH濃度再增加時(shí)對(duì)酶活性的影響不大，而且考慮到NADPH價(jià)格昂貴，故最終選擇2mmol/L作為NADPH在5α-R酶促反應(yīng)體系中的適宜添加濃度。如圖4所示，在0.1~2mmoL范圍內(nèi)，隨著T濃度的增加，酶活性不斷上升，選擇酶活性最高時(shí)對(duì)應(yīng)的2mmol/L作為T在5α-R酶促反應(yīng)體系中的適宜添加濃度。如圖5所示，5α-R提取物濃度在0.38~0.76mg/mL范圍時(shí)，隨著提取物濃度增加，酶活力逐漸上升，在濃度為0.76mg/mL時(shí)達(dá)到最高值，之后隨著提取物濃度的增大酶活力反而降低，因此確定0.76mg/mL為5α-R提取物濃度在5α-R酶促反應(yīng)體系中的適宜添加濃度。

最終確定的反應(yīng)條件如下：pH為7.4的磷酸鹽緩沖液300μL，添加濃度為0.76mg/mL的粗酶提取物500μL，添加濃度為2mmol/L的T50μL，樣品50μL,添加濃度為2mmol/L的NADPH100μL，反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為30min。

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