2、線性與精密度考察

（1）標準曲線溶液制備

GC：精密量取對照品儲備液0.5、1.0、2.0、4.0、5.0mL分別置于10mL量瓶中，用無水乙醇定容，得標準曲線溶液，按色譜柱：AgilentZORBAXEclipseXDB-C18(4.6x250mm，5μm)，流動相為甲醇(A)-20mmo/L乙酸銨溶液(B)，梯度洗脫(0～8min，10%A；8.1～20min，30%A；20.1～30min，10%A)，流速為1.0mL/min，進樣量為10uL，柱溫為35℃，檢測波長為210nm。HPLC：精密量取對照品儲備液0.04、0.4、1.0、1.5、2.0mL分別置于10mL量瓶中，用50%甲醇溶液定容，得標準曲線溶液。

GC-MS：精密量取對照品儲備液1mL置10mL量瓶中，加無水乙醇制成濃度為100μg/mL的對照品使用液，再精密量取0、0.4、0.2、0.5、1.0、2.0mL分別置于10mL量瓶中，用無水乙醇定容，得標準曲線溶液，按色譜條件:色譜柱為J&WDB-624UI(60mx0.25mmx1.4μm)，升溫程序為初始溫度60℃，保持1min，以50℃/min升溫至150℃，保持2min，再以10℃/min升溫至250℃，保持26min；載氣為氦氣，初始流量1mL/min，保持20min，以2mL/min升至2mL/min，保持20min，進樣口溫度250℃，分流比10:1，進樣量1μL。

（2）測定結(jié)果

分別以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，測定結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，三種方法的相關(guān)系數(shù)均達到＞0.999，且精密度RSD均＜2%，表明線性和精密度良好。

3、檢出限和定量限

精密量取各對照品溶液，以信噪比S/N=3和S/N=10為依據(jù)分別制成檢出限溶液和定量限溶液，GC、HPLC、GC-MS三種方法的檢出限分別5mgkg、10mg/kg和2mg/kg；定量限分別為17mg/kg、33mg/kg和6.7mg/kg?？梢?，GC-MS的檢出限最低，靈敏度相對較高，HPLC的檢出限相對較高，靈敏度相對較低。

4、回收率考察

取已知含量的某口服液0.5g各9份，根據(jù)曲線范圍，按低、中、高濃度分別精密加入各自的對照品儲備液(GC加入1、3、5mL，HPLC加入1、2、3mL，GC-MS加入0.1、0.3、0.5mL)，每個濃度3份，按各自的溶液制備方法制備回收率溶液，三種方法的回收率測定結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，三種方法的回收率均在90%～100%之間，方法的準確性良好。

5、穩(wěn)定性考察

取三種方法制備的標準曲線中點濃度溶液和回收率考察的樣品溶液，在室溫條件下，分別于0、0.5、1、2、4、8、16、24h時在各自的色譜條件下測定，計算各時間點苯甲醇峰面積的RSD%。GC為1.1%、1.3%，HPLC為0.8%、0.9%，GC-MS為1.4%、1.3%，均小于2%，表明三種方法在室溫下具有良好的穩(wěn)定性，能滿足日常檢驗的需求。

6、樣品前處理方法的考察

依據(jù)GB5009.28-201方法，取含蛋白質(zhì)的樣品1.0g，加入適量的苯甲醇標準物質(zhì)，再加入92g/L亞鐵氰化鉀和183g/L乙酸鋅溶液各0.5mL后，精密稱取苯甲醇對照品25mg置于10mL量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋并定容，得對照品儲備液。取樣品混勻，精密稱取1.0g置于25mL量瓶中，加適量50%甲醇溶液超聲提取10min，冷卻至室溫后定容，0.22μm濾膜濾過，得樣品溶液高效液相色譜法項下制備樣品溶液并測定含量，并與未加入蛋白質(zhì)沉淀劑的加標樣品溶液測定結(jié)果進行比較。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)沉淀劑對苯甲醇的測定無影響。

依據(jù)GB5009.139-2014方法，取含苯甲醇的樣品1.0g，置于25mL量瓶中，加適量50%甲醇溶液超聲提取10min后定容至刻度，再加入0.5g輕質(zhì)氧化鎂混勻，0.22μm濾膜濾過后按色譜柱：AgilentZORBAXEclipseXDB-C18(4.6x250mm，5μm)，流動相為甲醇(A)-20mmo/L乙酸銨溶液(B)，梯度洗脫(0～8min，10%A；8.1～20min，30%A；20.1～30min，10%A)，流速為1.0mL/min，進樣量為10uL，柱溫為35℃，檢測波長為210nm色譜條件測定含量，并與未加入氧化鎂的樣品測定結(jié)果進行比較。結(jié)果表明，輕質(zhì)氧化鎂對苯甲醇的測定無影響。

依據(jù)GB5009.140-2003方法，取含苯甲醇的樣品1.0mL，置于中性氧化鋁(100～200目)柱中，用50%甲醇溶液洗脫至25mL容量瓶中，0.22μm濾膜濾過后測定含量，并與未過中性氧化鋁柱的樣品測定結(jié)果進行比較。結(jié)果表明，中性氧化鋁柱對苯甲醇的測定無影響。

7、樣品的測定

收集市售的40批液體型保健食品，精密稱取苯甲醇對照品50mg置于50mL量瓶中，加無水乙醇稀釋并定容，得對照品儲備液。取樣品混勻，精密稱取1.0g，置于10mL量瓶中，加無水乙醇溶解并超聲提取10min，冷卻至室溫后定容，0.22μm濾膜濾過，得樣品溶液。精密稱取苯甲醇對照品25mg置于10mL量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋并定容，得對照品儲備液。取樣品混勻，精密稱取1.0g置于25mL量瓶中，加適量50%甲醇溶液超聲提取10min，冷卻至室溫后定容，0.22μm濾膜濾過，得樣品溶液。對照品儲備液同氣相色譜法項下儲備液。取樣品混勻，精密稱取1.0g，置于10mL量瓶中，加無水乙醇溶解并超聲提取10min后定容，0.22μm濾膜濾過，精密量取續(xù)濾液0.1mL置于10mL量瓶中，加無水乙醇定容，得樣品溶液。

在色譜柱:J&WDB-WAX(60mx0.25mmx0.25μm)，升溫程序為初始溫度150℃，10℃/min升到180℃，保持3min，20℃/min升到230℃，保持5min；載氣為氮氣，恒流速度1.0mL/min，分流比10:1，檢測器溫度250℃，進樣口溫度240℃，進樣量1μL。色譜柱:AgilentZORBAXEclipseXDB-C18(4.6x250mm，5μm)，流動相為甲醇(A)-20mmo/L乙酸銨溶液(B)，梯度洗脫(0～8min，10%A；8.1～20min，30%A；20.1～30min，10%A)，流速為1.0mL/min，進樣量為10uL，柱溫為35C，檢測波長為210nm。色譜條件:色譜柱為J&WDB--624UI(60mx0.25mmx1.4μm)，升溫程序為初始溫度60℃，保持1min，以50℃/min升溫至150℃，保持2min，再以10℃/min升溫至250℃，保持26min；載氣為氦氣，初始流量1mL/min，保持20min，以2mL/min升至2mL/min，保持20min，進樣口溫度250℃，分流比10:1，進樣量1μL條件下測定，根據(jù)苯甲醇標準曲線范圍調(diào)整樣品的稀釋體積，結(jié)果表明，有7批樣品檢出含苯甲醇，三種方法的測定結(jié)果一致(見表3)，相對標準偏差均小于5%。

7、三種方法比較

GC是測定揮發(fā)性或半揮發(fā)性成分的首選方法，其靈敏度好，進樣量小，檢測效率較高，檢測成本低，但是僅采用保留時間定性，當樣品中有雜質(zhì)干擾時，需要調(diào)整升溫程序?qū)崿F(xiàn)最佳分離效果。

HPLC是實驗室最普及的檢測手段，在測定苯甲醇含量時，可以根據(jù)光譜圖進行定性判定，但由于苯甲醇的最大吸收波長在210nm附近，屬末端吸收，沒有明顯的吸收特征，當有雜質(zhì)干擾時，可能會影響判定的準確性。但從本文的測定結(jié)果看，本方法與測定波長相近的10-羥基癸烯酸等功效性指標的分離度很高，受雜質(zhì)干擾較少。

GC-MS相比前兩種方法，其靈敏度最高，根據(jù)質(zhì)譜圖定性判定，并可準確定量，但儀器使用和維護成本較高，推薦作為GC和HPLC的輔助判定方法。

三、結(jié)論

本文建立的三種苯甲醇測定方法操作簡單，準確性高，穩(wěn)定性好，實驗室可根據(jù)條件選擇適宜的檢驗方法。三種方法相比，推薦使用HPLC法進行測定，GC-MS法輔助判定，也可直接采用GC-MS法，提高監(jiān)測效率。

《保健食品備案產(chǎn)品可用輔料及其使用規(guī)定(2019年版)》中規(guī)定的苯甲酸及其鈉鹽在液體制劑中的最大使用量為1g/kg；在GB/T2731-2017《日用香精》1161中規(guī)定，芐醇(即苯甲醇)在第1類加香產(chǎn)品(唇用產(chǎn)品、玩具)中，最高限量為0.2%(即2g/kg)；根據(jù)JECFA提出的芐基化合物的總使用限值要求0～5mgkg體重(以苯甲酸當量計)，以成年人體重60kg計算，苯甲酸類ADI為0～300mg/d這幾個標準均可作為制定食品或保健食品中苯甲醇限量的參考依據(jù)。

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