沙門氏菌(Salmonella)病又稱副傷寒，是一種在毛皮動物養(yǎng)殖過程常見的急性傳染病，常發(fā)于6—8月，呈地方性流行，主要表現癥狀為發(fā)熱，下痢腹瀉，體重減輕，出現神經癥狀，流產等。英國、丹麥、加拿大等國均有北美水貂(Mustelavison)感染沙門氏菌患病的報道，國內，在我國河北、東北三省、山東等地區(qū)也有相關病例報道。目前，沙門氏菌的預防與治療以抗生素藥物為主。近年來對沙門氏菌的耐藥性研究結果顯示，人源、動物源沙門氏菌的多重耐藥情況和耐藥程度逐年遞增，并通過飲水和食物等方式在人和動物之間不斷傳遞?？股仡愃幬餅E用，給細菌造成選擇壓力是造成多重耐藥情況日益嚴重的主要原因之一，因此，在養(yǎng)殖中合理應用治療動物疾病尤為重要。

為調查秦皇島地區(qū)北美水貂沙門氏菌的檢出率及耐藥情況，對65份水貂樣品中的細菌進行分離純化，采用細菌的鑒定培養(yǎng)、革蘭氏染色、生化鑒定和16SrDNA鑒定分離菌，采用小鼠致病性試驗研究分離菌株的致病性，采用KB紙片法檢測分離菌的耐藥性。結果顯示，經鑒定共計分離出9株沙門氏菌，分離率13.85%(9/65)；9株沙門氏菌均可致小鼠發(fā)病死亡，死亡率20%—100%；9株沙門氏菌分別對5—11種抗生素藥物耐藥，氟苯尼考、替米考星、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和復方新諾明的耐藥率高達100%，土霉素敏感率最高，為88.89%(8/9)。上述研究結果表明，秦皇島地區(qū)從水貂分離到的沙門氏菌均具有一定的致病力和多重耐藥性，為該地區(qū)水貂沙門氏菌病的防治提供參考。

本文對2019年秦皇島地區(qū)送檢北美水貂的沙門氏菌攜帶情況進行調查，并對分離菌株的致病性和耐藥性進行研究，旨在為該地區(qū)北美水貂沙門氏菌病的防治提供數據支持。

1材料與方法

1.1樣品

2019年3—9月收集秦皇島地區(qū)病死北美水貂病料65份，30—180日齡不等。

1.2主要試劑

H.E.瓊脂培養(yǎng)基購自青島海博生物公司；革蘭氏染色液購自京博奧拓達科技有限公司；ID32E腸桿菌科和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑條購自法國梅里埃公司；D2000plusDNAladder，購自中科瑞泰科技有限公司；2×TaqMasterMix，細菌DNA基因組提取試劑盒，膠回收試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；pMD19-T載體，購自寶日醫(yī)(TaKaRa)生物技術有限公司；藥敏紙片購自杭州天和微生物科技股份有限公司；序列測定服務由上海生工生物工程公司提供。昆明小鼠(體重20±5g)購自北京維通利華試驗動物有限公司。

1.3引物

細菌16SrDNA鑒定通用引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列為27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R:TACGGYTACCTTGTTACGACTT。

1.4細菌的分離純化

無菌采取病死水貂肝臟、脾臟、心臟，于超凈臺中接種于H.E.瓊脂培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18—24h，挑取黑綠色且中心有黑點的菌落重新于H.E.培養(yǎng)基中劃線純化培養(yǎng)18—24h，挑取符合上述特征的單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫搖床培養(yǎng)18—24h。

1.5分離菌的革蘭氏染色

挑取純化后的單菌落進行革蘭氏染色，染色操作按照試劑說明書進行，染色后在光學顯微鏡下觀察細菌的染色特征和形態(tài)。

1.6分離菌的生化鑒定

生化鑒定試驗參照ID32E腸桿菌科和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑條進行，用ATB自動生化鑒定系統對結果判定。

1.7分離菌的16SrDNA鑒定

按照細菌DNA基因組提取試劑盒說明書提取分離菌的DNA作為PCR模板。PCR體系為：上、下游引物和模板各1μL，ddH2O22μL，2×TaqMasterMix25μL，總體積為50μL。PCR擴增反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。用膠回收試劑盒回收1500bp左右條帶，回收產物連接pMD19-T載體并轉入DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取陽性菌落置于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)，送上海生工生物工程公司測序。測序結果在NCBI的BLAST分區(qū)檢索并比對分析。

1.8分離菌的致病性試驗

參考文獻中的劑量與方法，每株分離菌分別感染5只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.2mL用高壓滅菌后的PBS調整濃度后的菌液(濃度1×108cfu/mL)，設置對照組一組，每只小鼠注射0.2mL的無菌PBS，其余條件與分離菌感染組相同。觀察并記錄小鼠死亡發(fā)病情況。

1.9分離菌的藥物敏感性試驗

按照美國臨床和試驗室標準協會(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI)標準的操作和判準，采用KB紙片法檢測分離菌對β-內酰胺類(氨芐西林、頭孢曲松、阿莫西林)，氨基糖苷類(阿米卡星、新霉素、卡那霉素)，四環(huán)素類(多西環(huán)素、土霉素)，氟喹諾酮類(環(huán)丙沙星、恩諾沙星)，氯霉素類(氟苯尼考)，大環(huán)內酯類(替米考星)，磺胺類(磺胺間甲氧、磺胺二甲氧、復方新諾明)，共計15種抗生素的敏感性。

2結果

2.1細菌的分離純化

從65份樣品中共計分離出9株疑似沙門氏菌的菌株。疑似菌株在H.E.瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)菌落呈圓形，邊緣整齊，微凸，藍綠色，菌落中間有黑點(圖1A)。

2.2分離菌的革蘭氏染色

經革蘭氏染色，9株分離菌均為革蘭氏陰性短桿菌，兩端鈍圓(圖1B)。

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