黃皮屬植物隸屬于蕓香科Rutaceae，全世界約有30種，主要分布于東半球的熱帶和亞熱帶地區(qū)。分布于我國的黃皮屬植物約有10種以及2變種，其中1種為引進(jìn)栽培種，集中分布于海南、廣西、廣東以及云南等南部省區(qū)。黃皮屬植物大多為民間藥用，藥用歷史悠久，療效顯著，具有行氣止痛、解毒散結(jié)的功效，常用于治療感冒、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及胃痛等。現(xiàn)代植物化學(xué)研究表明黃皮屬植物中富含香豆素類、生物堿類、木脂素類、倍半萜類、黃酮苷類、二萜類以及檸檬苦素類等多種結(jié)構(gòu)類型的化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃皮屬植物中分離得到的化學(xué)成分具有抗炎活性、抗腫瘤活性、抗真菌活性、抗病毒活性、神經(jīng)保護(hù)活性以及保肝活性等多種生物活性。假黃皮Clausena excavata為蕓香科黃皮屬植物，分布于我國的海南、云南、廣東、廣西、福建、臺灣等省區(qū)。假黃皮為民間藥用植物，具有行氣、止痛、驅(qū)風(fēng)、去濕的功效?，F(xiàn)代植物化學(xué)和藥理活性研究表明假黃皮中富含結(jié)構(gòu)類型豐富、生物活性顯著的化學(xué)成分。

本課題組在前期研究中對假黃皮枝葉的90%乙醇提取物的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性進(jìn)行了初步評價，結(jié)果表明假黃皮枝葉的90%乙醇提取物具有顯著的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性。為了更合理地開發(fā)利用該藥用植物資源，充分發(fā)揮其藥用價值，本課題組對假黃皮枝葉的90%乙醇提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，從中分離得到了19個化合物，分別鑒定為：苔色酸甲酯(1)、丁香脂素(2)、lenisin A(3)、東莨菪素(4)、歐前胡素酚(5)、N-benzoyltyrarnine methyl ether(6)、N-p-coumaroyltyramine(7)、aurantiamide acetate(8)、1H-indole-3-carboxaldehyde(9)、furostifoline(10)、clausenalansine E(11)、3-formylcarbazole(12)、clausine L(13)、clausine E(14)、methyl carbazole-3-carboxyaate(15)、glycosinin(16)、murrayafoline A(17)、clausine H(18)和2, 7-dihydroxy-3-formyl-1-(3'-methyl-2'-butenyl)carbazole(19)。其中化合物1～11為首次從假黃皮中分離得到，化合物1、2、10為首次從黃皮屬植物中分離得到。此外，通過對化合物1～19的體外抑制MH7A滑膜成纖維細(xì)胞增殖的活性進(jìn)行評價化合物1～19的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性，結(jié)果表明化合物10～19表現(xiàn)出了較為顯著的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性，它們對MH7A滑膜成纖維細(xì)胞增殖的抑制活性的IC50為(27.63±0.18)～(235.67±2.16) μmol·L^-1。

1 材料

中低壓制備色譜(瑞士Buchi公司)；Agilent 1200分析型高效液相色譜儀(美國Agilent Technologies有限公司)；Cosmosil C18分析型色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Cosmosil C18制備型色譜柱(20 mm×250 mm，5 μm)；Thermo Fisher UltiMate 3000制備型高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Finnigan LCQ Advantange MAX 質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Bruker AV-400型超導(dǎo)核磁共振儀(德國Bruker公司)；Sephadex LH-20凝膠(美國Amersham Blosclences公司)；薄層硅膠GF254和柱色譜硅膠(青島海洋化工廠)；ODS色譜材料(C18，10～40 μm，德國Merck公司)；N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA公司)；YOKO-ZX紫外分析暗箱(武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司)；4001N電子天平(上海民橋精密科技儀器有限公司)；OLYM PUS-IX70型生物倒置顯微鏡(日本Olym-pus公司)；Tecan Infinite Pro全波長多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；BHC-1300B2型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；Thermo HERAcell 240i型CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；噻唑藍(lán)(美國Sigma公司)；F12培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液、胰蛋白酶、胎牛血清和雙抗(美國Hyclone公司)；MH7A滑膜成纖維細(xì)胞來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫ATCC(American type culture collection)細(xì)胞庫，購自于上海冠導(dǎo)生物工程有限公司。其他試劑均為分析純試劑或者色譜試劑 (西隴化工股份有限公司)。

假黃皮枝葉于2019年10月采集于云南省西雙版納傣族自治州西雙版納國家級自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)海南師范大學(xué)熱帶藥用資源化學(xué)教育部重點實驗室付艷輝研究員鑒定為蕓香科黃皮屬植物假黃皮C. excavata的枝葉，憑證標(biāo)本(No.CLEX20191002)保存于海南師范大學(xué)海南師范大學(xué)熱帶藥用資源化學(xué)教育部重點實驗室植物標(biāo)本室。

2 提取分離

將陰干的假黃皮枝葉19.8 kg粉碎后用90%乙醇冷浸提取3次，每次提取7 d，得乙醇提取總浸膏(1 113.8 g)。乙醇提取總浸膏(1 110.0 g)經(jīng)硅膠柱色譜分離，以氯仿-甲醇體系為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫(100:0～35:65)，得到8個流分Fr.1～Fr.8。Fr. 2(48.7 g)經(jīng)反相ODS柱色譜分離，以甲醇-水體系為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫(65:35～100:0)，得到6個亞流分(Fr.2A～Fr.2F)。Fr.2B(6.2 g)經(jīng)硅膠柱色譜進(jìn)行分離，以石油醚-丙酮體系為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫(95:5～30:70)，再經(jīng)制備型HPLC(DAD檢測器；檢測波長為210、230、254、280 nm)制備(乙腈-水65:35)得到化合物1 (21.3 mg)、7 (54.2 mg)、12 (63.6 mg)、14 (6.3 mg)和17 (21.5 mg)；Fr.2C(5.7 g)經(jīng)硅膠柱色譜進(jìn)行分離，以石油醚-丙酮(80:20～25:73)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，再經(jīng)制備型HPLC(DAD檢測器；檢測波長為210、230、254、280 nm)制備(甲醇-水73:27)得到化合物2 (42.1 mg)、8 (7.9 mg)、13 (8.6 mg)、16 (53.5 mg)、18 (74.1 mg)；Fr. 3(55.3 g)經(jīng)反相ODS柱色譜分離，以甲醇-水體系為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫(55:45～100:0)，得到7個亞流分(Fr.3A～Fr.3G)；Fr.3B(6.7 g)經(jīng)硅膠柱色譜進(jìn)行分離，以石油醚-丙酮體系為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫(85:15～20:80)，再經(jīng)制備型HPLC(DAD檢測器；檢測波長為210、230、254、280 nm)制備(乙腈-水58:42)得到化合物3 (7.8 mg)、4 (9.3 mg)、9 (15.8 mg)、15 (87.3 mg)；Fr. 4(64.6 g)經(jīng)反相ODS柱色譜分離，以甲醇-水體系為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫(45:55～100:0)，得到6個亞流分(Fr.4A～Fr.4F)；Fr.4B (8.3 g)經(jīng)硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫(80:20～30:70)，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇-水70:30)純化后再經(jīng)制備型HPLC(DAD檢測器；檢測波長為210、230、254、280 nm)制備(甲醇-水60:40)得到化合物5 (8.7 mg)、6 (9.7 mg)、10 (31.6 mg)、11 (42.5 mg)、19 (22.3 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色無定型粉末，三氯化鐵顯色反應(yīng)陽性；C9H10O4，ESI-MS m/z 183 +；1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 11.78 (1H, s, 2-OH), 6.28 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-5), 6.23 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-3), 3.91 (3H, s, 7-OCH3), 2.47 (3H, s, 6-CH3)；13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 172.3 (C-7), 165.5 (C-2), 160.9 (C-4), 144.0 (C-6), 111.6 (C-5), 105.6 (C-1), 101.4 (C-3), 52.0 (7-OCH3), 24.4 (6-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中報道的苔色酸甲酯的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物1為苔色酸甲酯。

化合物2 白色無定型粉末，三氯化鐵顯色反應(yīng)陽性；C22H26O8，ESI-MS m/z 419 +；1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 5.59 (1H, s, H-10, 14, 16, 20), 4.72 (1H, d, J = 4.2 Hz, H-2), 4.28 (1H, dd, J = 9.0, 7.2 Hz, H-4β, 8β), 3.91 (1H, dd, J = 9.0, 3.6 Hz, H-4α, 8α), 3.89 (3H, s, 11, 13, 17, 19-OCH3), 3.10 (1H, m, H-5)；13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 147.3 (C-11, 13, 17, 19), 134.4 (C-12, 18), 132.2 (C-9, 15), 102.8 (C-10, 14, 16, 20), 86.2 (C-2, 7), 71.9 (C-4, 8), 56.5 (11, 13, 17, 19-OCH3), 54.4 (C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中報道的丁香脂素的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物2為丁香脂素。

化合物3 白色無定型粉末；C16H24O5, ESI-MS m/z 297 +；1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 6.41 (2H, s, H-2, 6), 5.94 (1H, m, H-8), 5.10 (2H, m, H-9), 4.41 (1H, dd, J = 10.6, 2.5 Hz, H-1'α), 3.86 (1H, dd, 10.6, 8.2 Hz, H-1'β) 3.63 (1H, dd, J = 8.2, 2.5 Hz, H-2'), 3.85 (6H, s, 3, 5-OCH3), 3.33 (2H, d, J = 6.8 Hz, H-7), 1.25(3H, s, H-5'), 1.25 (3H, s, H-4')；13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 152.9 (C-3, 5), 137.1 (C-1), 136.4 (C-8), 135.3 (C-4), 116.3 (C-9), 105.5 (C-2, 6), 75.9 (C-2'), 75.7 (C-1'), 71.5 (C-3'), 56.2 (3, 5-OCH3), 40.7 (C-7), 26.9 (C-5'), 25.1 (C-4')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中報道的lenisin A的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物3為lenisin A。

化合物4 淡黃色無定形粉末，異羥肟酸鐵顯色反應(yīng)陽性；C10H8O4, ESI-MS m/z 193 +；1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.60 (1H, d, J = 9.8 Hz, H-4), 6.91 (1H, s, H-8), 6.84 (1H, s, H-5), 6.26 (1H, d, J = 9.8 Hz, H-3), 3.95 (3H, s, 6-OCH3)；13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 161.5 (C-2), 150.3 (C-6), 149.7 (C-9), 144.0 (C-7), 143.3 (C-4), 113.4 (C-3), 111.5 (C-10), 107.5 (C-5), 103.2 (C-8), 56.4 (6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中報道的東莨菪素的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物4為東莨菪素。

化合物5 淡黃色無定形粉末，異羥肟酸鐵顯色反應(yīng)陽性；C14H14O3, ESI-MS m/z 231 +；1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.63 (1H, d, J = 9.8 Hz, H-4), 7.22 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-5), 6.81 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-6), 6.24 (1H, d, J = 9.8 Hz, H-3), 5.28 (1H, dd, J = 7.2, 5.7 Hz, H-2'), 3.61 (2H, d, J = 7.2 Hz, H-1'), 1.85 (3H, s, H-4'), 1.75 (3H, s, H-5')；13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 161.9 (C-2), 158.5 (C-7), 153.3 (C-9), 144.3 (C-4), 136.0 (C-3'), 126.7 (C-5), 120.5 (C-2'), 115.0 (C-8), 113.3 (C-3), 112.9 (C-10), 112.6 (C-6), 26.0 (C-4'), 22.2 (C-1'), 18.1 (C-5')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的歐前胡素酚的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物5為歐前胡素酚。

化合物6 白色無定形粉末，改良碘化鉍鉀顯色反應(yīng)陽性；C16H17NO2, ESI-MS m/z 256 +；1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 8.54 (1H, br t, NH), 7.81 (2H, m, H-2, 6), 7.50 (1H, m, H-4), 7.45 (2H, m, H-3, 5), 7.15 (2H, d, J = 8.6, H-2', 6'), 6.86(2H, d, J = 8.6, H-3', 5'), 3.71 (3H, s, 4'-OCH3), 3.45 (2H, t, J = 7.0, H-8'), 2.77 (2H, t, J = 7.0, H-7')；13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ: 166.2 (C-7), 157.8 (C-4'), 134.7 (C-1), 131.5 (C-4), 131.2 (C-1'), 129.7 (C-2, 6), 128.4 (C-3, 5), 127.2 (C-2', 6'), 113.9 (C-3', 5'), 55.1 (4'-OCH3), 41.2 (C-8'), 34.3 (C-7')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的N-benzoyltyrarnine methyl ether的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物6為N-benzoyltyrarnine methyl ether。

化合物7 白色無定形粉末，改良碘化鉍鉀顯色反應(yīng)陽性；C17H17NO3, ESI-MS m/z 284 +；1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 7.37 (2H, d, J = 8.2 Hz, H-2', 6'), 7.29 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-β), 7.00 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2'', 6''), 6.67 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3'', 5''), 6.77 (2H, d, J = 8.2 Hz, H-3', 5'), 6.38 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-α), 3.30 (2H, t, J = 7.4 Hz, H-2), 2.63 (2H, t, J = 7.4 Hz, H-l)；13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ: 165.6 (C=O), 159.0 (C-4''), 155.7 (C-4'), 138.9 (C-β), 129.7 (C-2', 6'), 129.7 (C-1'), 129.4 (C-2'', 6''), 126.0 (C-1''), 118.7 (C-α), 115.9 (C-3', 5'), 115.3 (C-3'', 5''), 40.9 (C-1), 34.5 (C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的N-p-coumaroyltyramine的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物7為N-p-coumaroyltyramine。

化合物8 白色無定形粉末，改良碘化鉍鉀顯色反應(yīng)陽性；C27H30N2O4, ESI-MS m/z 447 +；1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.72 (2H, m, H-3', 7'), 7.52 (1 H, m, H-5'), 7.44 (2H, m, H-4', 6'), 7.31 (2H, m, H-19), 7.29 (1H, m, H-17), 7.27 (2H, m, H-18), 7.26 (2H, m, H-16), 7.24 (2H, m, H-15), 7.17 (1H, m, H-10), 7.14 (2H, m, H-8, 12), 7.06 (2H, m, H-9, 11), 6.81 (1H, d, J = 7.7 Hz, 1-NH), 6.07 (1 H, d, J = 8.6 Hz, 4-NH), 4.78 (1H, d, J = 8.1, 5.9 Hz, H-2), 4.34 (1H, d, J = 8.1, 5.9 Hz, H-5), 3.82 (1H, dd, J = 11.3, 4.2 Hz, H-20), 3.93 (1H, dd, J = 11.3, 4.9 Hz, H-20), 3.06 (1H, dd, J = 13.7, 8.3 Hz, H-13), 3.21 (1H, dd, J = 13.7, 5.9 Hz, H-13), 2.76 (2H, m, H-6), 2.02 (3H, s, H-2'')；13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 170.9 (C-1''), 170.4 (C-3), 167.3 (C-1'), 136.8 (C-7), 136.7 (C-14), 133.8 (C-2'), 132.1 (C-5'), 129.4 (C-16, 18), 129.3 (C-9, 11), 129.0 (C-15), 128.9 (C-4', 6'), 128.8 (C-8), 128.6 (C-19), 127.3 (C-13), 127.2 (C-3', C-7'), 126.9 (C-10), 64.7 (C-20), 55.1 (C-2), 49.6 (C-5), 38.6 (C-13), 37.6 (C-6), 20.94 (C-2'')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的aurantiamide acetate的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物8為aurantiamide acetate。

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