（3）除蛋白質(zhì)中離心時(shí)間的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵液細(xì)胞分離后，加入50%的三氯乙酸溶液1/5體積，在16000×g的離心力下分別離心10min、20min、30min、40min，選取最優(yōu)化離心時(shí)間，如圖4所示。離心的時(shí)間選取30～40min為最佳。

3、乙醇沉淀多糖條件的優(yōu)化

（1）乙醇沉淀多糖中乙醇濃度的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵液細(xì)胞分離后，加入50%的三氯乙酸溶液1/5體積，在16000×g的離心力下分別離心40min，加入3倍體積濃度分別為70%、80%、95%、100%的乙醇溶液，4℃條件下醇沉12h。透析，測(cè)定胞外多糖的產(chǎn)量，如圖5所示。多糖的提取量隨著乙醇濃度的增加而不斷增大。一些小分子的多糖分子在低濃度的乙醇下不易沉淀，只有當(dāng)乙醇濃度足夠高時(shí)，才發(fā)生沉淀。因此當(dāng)乙醇濃度為100%時(shí)，達(dá)到最大值，即乙醇沉淀多糖的最優(yōu)濃度為100%。

（2）乙醇沉淀多糖中乙醇體積的優(yōu)化

蛋白沉淀后分別按照1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的料醇比加入濃度為100%的乙醇溶液，測(cè)定胞外多糖的產(chǎn)量，如圖6所示。增加乙醇添加體積可以提高胞外多糖的獲得量，沉淀中多糖提取率隨乙醇添加倍數(shù)的增加而升高，但是當(dāng)乙醇添加倍數(shù)在3～4倍時(shí)，EPS含量明顯提高，且都達(dá)到較高濃度，所以從提取成本考慮，最佳的乙醇添加倍數(shù)為3倍。

（3）乙醇沉淀多糖中沉淀時(shí)間的優(yōu)化

乙醇沉淀多糖中在4℃條件下分別醇沉12h、24h、36h，測(cè)定胞外多糖的產(chǎn)量，如圖7所示。醇沉?xí)r間與胞外多糖含量的關(guān)系不明顯。而實(shí)驗(yàn)過程中，加入乙醇后立即產(chǎn)生沉淀，并且隨著醇沉?xí)r間的增加，沉淀物顏色不斷加深。為了保證粗多糖的純度，醇沉?xí)r間選12h最宜。

4、正交實(shí)驗(yàn)分析

分別選取影響EPS含量較大的提取條件，三氯乙酸濃度、離心力和離心時(shí)間進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1。結(jié)果表明，影響EPS含量的各因素主次關(guān)系為B＞C＞A，離心力對(duì)多糖提取的影響較大，離心時(shí)間次之，三氯乙酸濃度對(duì)多糖提取的影響最小。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出最優(yōu)發(fā)酵條件組合為A₃B₂C₃，即60%的三氯乙酸濃度、在14000×g的離心力下離心40min。研究表明，離心力和離心時(shí)間的增加可以提高蛋白的脫離率，但會(huì)減少最終EPS含量，降低多糖提純得率，因此，在14000×g離心力下離心40min最佳，EPS含量可達(dá)到392.50mg/L。

三、結(jié)論

本項(xiàng)目以篩選出的胞外多糖高產(chǎn)菌乳酸乳球菌乳亞種LL9為菌種，進(jìn)行EPS提取純化工藝條件研究。使用三氯乙酸法沉淀蛋白質(zhì)，通過適當(dāng)控制三氯乙酸的用量來降低對(duì)EPS結(jié)構(gòu)的破壞。通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)最終驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用濃度為60%三氯乙酸處理過發(fā)酵液后，在14000×g離心力下離心40min除蛋白效果最佳；沉淀多糖的最優(yōu)組合是3倍體積、濃度為100%的乙醇沉淀12h。最優(yōu)化分離純化工藝條件為：添加三氯乙酸60%（w/v）（12h）→500r/min攪拌5min→離心沉淀除蛋白（4℃，14000×g，40min）→上清加乙醇沉淀多糖（100%，3倍體積，4℃，處理12h）→離心（12000×g，30min）→冷凍干燥→沉淀溫水溶解（稀釋10倍）→透析MD34（4℃，處理12h）。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證工藝流程合理并可行。EPS含量最后達(dá)到392.50mg/L，產(chǎn)量為原來的1.49倍。為今后進(jìn)一步純化和深入研究乳酸菌產(chǎn)胞外多糖的結(jié)構(gòu)和生物活性等提供參考。

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