杜仲Eucommia ulmoides Oliver是我國特產的名貴經(jīng)濟樹種，傳統(tǒng)上以皮入藥，應用歷史悠久?！吨腥A人民共和國藥典》2020年版中，杜仲以皮和葉入藥，具有補肝腎、強筋骨之效，用于治療肝腎不足、腰脊酸痛、筋骨無力、頭暈目眩等。由于杜仲皮來源有限，研究表明，杜仲葉與杜仲皮有相同的功效，具有降血壓、降血糖、保護肝臟等多種藥理作用。杜仲葉的降壓作用機制與內皮依賴性有關，同時三磷酸腺苷敏感性鉀離子通道也參與了杜仲葉的舒血管作用。杜仲葉對肝損傷和肝纖維化有顯著的療效。研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉提取物能顯著升高Wistar大鼠肝臟中谷胱甘肽（GSH）水平，同時降低丙二醛（MDA）水平，從而改善肝臟病變程度（包括肝細胞壞死、纖維結締組織增生等）。杜仲葉中的單體成分原兒茶酸、綠原酸對大鼠或小鼠的肝損傷也有明顯的保護作用，而桃葉珊瑚苷及其苷元則可抑制轉化生長因子-β1（TGF-β1）對肝星狀細胞（HSC）的激活和肝內細胞外基質（ECM）的沉積，從而起到護肝的作用。由于杜仲葉顯著的功效，日本將其開發(fā)成杜仲茶等功能飲料，風靡一時。我國目前也有杜仲茶相關的產品開發(fā)。為探明杜仲葉中的降壓和保肝活性成分，明確其藥效物質。本課題組前期對杜仲葉的化學成分進行了系統(tǒng)研究，并考察了其降壓及保肝活性。本研究利用現(xiàn)代色譜分離技術，從杜仲葉的80%乙醇提取物中分離得到13個黃酮類化合物，經(jīng)核磁共振（NMR）方法鑒定其結構，分別為圣草素（eriodictyol,1）、柚皮素（naringenin,2）、山柰素（kaempferol,3）、洋芹素（apigenin,4）、山柰素-3-O-α-L-鼠李糖苷（kaempferol-3-O-α-L-rhamnoside,5）、紫云英苷（astragalin,6）、山柰素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷（kaempferol-3-O-α-L-arapyranoside,7）、山柰素-3-O-β-D-6?-乙酰基吡喃葡糖苷（kaempferol-3-O-β-D-6?-acetylglucopyranoside,8）、槲皮素（quercetin, 9）、槲皮素苷（quercetin-3-O-α-L-rhamnoside, 10）、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃木糖苷（quercetin-3-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-xylopyranoside,11）、葛根素（puerarin,12）、大豆苷（daidzin,13）。其中化合物1、4～8、10～11均為首次從杜仲中分離得到。

1 材料

ARX-400型核磁共振儀(德國Bruker公司)；SCIEX 5500 QTRAP型三重四級桿液相質譜聯(lián)用系統(tǒng)（美國AB SCIEX 公司）；e2695分析型高效液相色譜儀、2535制備型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Sepacore型中壓制備色譜(瑞士Buchi公司)；C18分析型色譜柱(250 mm× 4.6 mm, 5 μm)、C18制備型色譜柱(250 mm× 20 mm, 5 μm)均購于日本YMC公司；薄層色譜硅膠GF254和柱色譜硅膠(青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20 (瑞典Pharmacia公司)；所用試劑均為分析純試劑(天津康科德試劑公司)。

杜仲葉2014年購于保定安國藥材市場，產地為湖南，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學張麗娟教授鑒定為杜仲Eucommia ulmoides Oliver的干燥葉，留樣保存于天津中醫(yī)藥大學中藥學院。

2 提取與分離

杜仲葉藥材9.5 kg，粉碎后用7倍量體積分數(shù)80％的乙醇溶液回流提取3次，每次2 h。將乙醇溶液提取物濃縮至無醇味后，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次。合并各萃取層濃縮，得到石油醚層、三氯甲烷層、乙酸乙酯層（70 g）、正丁醇層（180 g）。乙酸乙酯層萃取物經(jīng)硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇(100:0→0:100)梯度洗脫，得到10個流分E1～E10。

合并E6和E7為E67（8.0 g），經(jīng)反相ODS開放柱色譜分離，甲醇-水(1:50→100:0)梯度洗脫，得到10個流分E670～E679。E674（1.9 g）經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，甲醇洗脫，得到10個流分E6740~E6749。E6749（31.0 mg）經(jīng)制備液相色譜分離，甲醇-水（55:45）洗脫，得到化合物1（10.0 mg）和2（14.0 mg）。E675（550.0 mg）經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，甲醇洗脫，得到10個流分E6750~E6759和化合物3（161.0 mg）。E6757（29.0 mg）經(jīng)制備液相色譜分離，甲醇-水（60:40，含0.1%甲酸）洗脫，得到化合物4（20.1 mg）。

E8（30 g）經(jīng)聚酰胺開放柱色譜分離，乙醇-水(1:100→100:0)洗脫，得到8個流分E81~E88。E86（3.0 g）經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，甲醇洗脫，得到6個流分E861~E866。E864（230.0 mg）經(jīng)制備液相色譜分離，甲醇-水（50:50）洗脫，得到化合物5（18.0 mg）、6（11.0 mg）、7（7.0 mg）和8（24.0 mg）。E87經(jīng)硅膠柱色譜分離（4.6 g），二氯甲烷-甲醇(100:0→0:100)洗脫，得到6個流分E871~E876。E874經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，甲醇洗脫，得到6個流分E8741~E8746。E8742經(jīng)制備液相色譜分離，甲醇-水（80:20，含0.1%甲酸），得到化合物9（2.5 g）。

E9（10 g）經(jīng)反相ODS開放柱色譜分離，甲醇-水(5:100→100:0)洗脫。得到5個流分E91~E95，其中E92和E93合并為E923 （640.0 mg），經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，甲醇洗脫，得到8個流分E9231~E9238。E9237（210.0 mg）經(jīng)制備液相色譜分離，甲醇-水（25:75）洗脫，得到化合物10（80.0 mg）。

E10（5.1 g）經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，甲醇洗脫，得到7個流分E101~E107。其中的流分E104（90.0 mg）經(jīng)制備液相色譜分離，甲醇-水（40:60）洗脫，得到化合物11（6.0 mg）。

正丁醇層萃取物經(jīng)硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇(100:0→0:100)梯度洗脫，得到8個流分B1~B8。B8（24 g）經(jīng)反相ODS柱色譜分離，甲醇-水(1:50→100:0)梯度洗脫,得到17個流分B8-1至B8-17。B8-7經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，甲醇洗脫，得到7個流分B8-7-1至B8-7-7，流分B8-7-5（105 mg）經(jīng)制備液相分離，甲醇-水（30:70）洗脫，得到化合物12（16.1 mg）和13（8.0 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：黃色固體粉末(甲醇)，分子式為C15H12O6。ESI-MS m/z：287.07 ﹣；1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 6.92 (1H, s, H-2?), 6.79 (2H, s, H-5?, 6?), 5.89 (1H, s, H-8), 5.88 (1H, s, H-6), 5.27 (1H, dd, J = 1.8, 2.6 Hz, H-2), 3.06 (1H, dd, J = 17.1, 12.8 Hz, H-3), 3.06 (1H, dd, J = 17.1, 2.7 Hz, H-3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 197.8 (C-4), 168.5 (C-7), 165.5 (C-5), 164.9 (C-9), 147.0 (C-4?), 146.6 (C-3?), 131.9 (C-1?), 119.3 (C-6?), 116.4 (C-5?), 114.8 (C-2?), 103.4 (C-10?), 96.3 (C-8), 80.6 (C-2), 44.2 (C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物1為圣草素。

化合物2：黃色固體(甲醇)，分子式為C15H12O5。ESI-MS m/z：271.07 ﹣；1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.32 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2?, 6?), 6.82 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3?, 5?), 5.90 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 5.88 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 5.34 (1H, dd, J = 12.9, 2.8 Hz, H-2), 3.11 (1H, dd, J = 17.1, 12.9 Hz, H-2), 2.70 (1H, dd, J = 17.1, 2.9 Hz, H-3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 197.9 (C-4), 168.6 (C-8), 165.1 (C-6), 159.2 (C-4?), 131.3 (C-1?), 129.2 (C-2?, 6?), 116.5 (C-3?, 5?), 103.5 (C-10), 97.2 (C-7), 165.0 (C-5), 96.3 (C-9), 80.6 (C-2), 44.2 (C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物2為柚皮素。

化合物3：黃色固體 (甲醇)，分子式為C15H10O6。ESI-MS m/z：285.05 ﹣；1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 8.07 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-2?, 6?), 6.90 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-3?, 5?), 6.38 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8), 6.17 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 177.5 (C-4), 165.7 (C-7), 162.6 (C-5), 160.7 (C-4?), 158.4 (C-9), 148.2 (C-2), 137.3 (C-3), 130.8 (C-2?, 6?), 123.9 (C-1?), 116.4 (C-3?, 5?), 104.7 (C-10), 99.4 (C-6), 94.6 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物3為山柰素。

化合物4：黃色固體粉末 (甲醇)，分子式為C15H10O5。ESI-MS m/z：269.05 ﹣；1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.96 (1H, s, 5-OH), 7.92 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-2?, H-6?), 6.92 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-3?, H-5?), 6.78 (1H, s, H-3), 6.48 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-8), 6.19 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 181.7 (C-4), 164.1 (C-2), 163.7 (C-7), 161.4 (C-9), 161.1 (C-4?), 157.3 (C-5), 128.4 (C-2?, 6?), 121.1 (C-1?), 115.9 (C-3?, 5?), 103.7 (C-10), 102.8 (C-3), 98.8 (C-6), 93.9 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物4為洋芹素。

化合物5：棕黃色固體 (甲醇)，分子式為C22H22O10。ESI-MS m/z：431.11 ﹣；1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.69 (1H, s, OH-5), 7.81 (2H, d, J = 8.1 Hz, H-2?, 6?), 6.94 (2H, d, J = 8.1 Hz, H-3?, 5?), 6.48 (1H, s, H-8), 6.27 (1H, s, H-6), 5.35 (1H, s, H-1??), 4.03 (1H, s, H-2??), 3.51 (1H, dd, J = 8.8, 3.1 Hz, H-3??), 3.16~3.22 (2H, m, H-4??, 5??), 0.84 (3H, d, J = 5.1 Hz, H-6??)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 178.2 (C-4), 164.7 (C-7), 161.7 (C-5), 160.4 (C-4?), 157.7 (C-9), 156.9 (C-2), 134.6 (C-3), 131.0 (C-2?, 6′), 120.9 (C-1′), 115.8 (C-3', 5′), 104.6 (C-10), 102.2 (C-1??), 99.2 (C-6), 94.2 (C-8), 71.6 (C-4??), 71.1 (C-3??), 70.8 (C-2??), 70.5 (C-5??), 17.9 (C-6??)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物5為山柰素-3-O-α-L-鼠李糖苷。

化合物6：棕黃色固體 (甲醇)，分子式為C21H20O11。ESI-MS m/z：449.10 ﹢；1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.61 (1H, s, OH-5), 8.04 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2?, 6?), 6.89 (2H, d, J = 8.1 Hz, H-3?, 5?), 6.43 (1H, s, H-8), 6.21 (1H, s, H-6), 5.46 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-1??), 3.07~3.58 (6H, m)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 177.9 (C-4), 164.6 (C-7), 161.7 (C-4?), 160.4 (C-5), 156.8 (C-9), 156.7 (C-2), 133.6 (C-3), 131.3 (C-2?, 6?), 121.4 (C-1?), 115.6 (C-3?, 5?), 104.5(C-10), 101.3 (C-1??), 99.1 (C-6), 94.1 (C-8), 78.0 (C-5??), 76.9 (C-3??), 74.7 (C-2??), 70.4 (C-4??), 61.3 (C-6??)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物6為紫云英苷。

化合物7：棕黃色固體 (甲醇)，分子式為C20H18O10。ESI-MS m/z：419.09 ﹢；1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.58 (1H, s, OH-5), 8.06 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-2?, 6?), 6.88 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3?, 5?), 6.33 (1H, s, H-6), 6.11 (1H, s, H-8), 5.32 (2H, d, J = 5.1 Hz, H-1??), 3.74 (1H, t, J = 6.5 Hz, H-2??), 3.65 (1H, s, H-3??), 3.57 (1H, dd, J = 11.5, 5.4 Hz, H-4??), 3.51~3.53 (1H, m, H-5??), 3.18~3.22 (1H, m, H-5??)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 177.2 (C-4), 164.2 (C-7), 161.1 (C-5), 160.1 (C-4′), 156.5 (C-2), 155.8 (C-9), 133.4 (C-3), 130.9 (C-2?), 130.9 (C-6?), 120.7(C-1?), 115.3 (C-3?), 115.3 (C-5?), 103.1(C-10), 101.3 (C-1??), 99.3 (C-6), 93.9(C-8), 71.6(C-3??), 70.8(C-4??), 66.0(C-2??), 64.2(C-5??)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物7為山柰素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。

化合物8：棕黃色固體 (甲醇)，分子式為C23H22O12。ESI-MS m/z：491.11 ﹢；1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.56 (1H, s, OH-5), 7.99 (2H, d, J = 8.3 Hz, H-3?, 5?), 6.88 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2?, 6?), 6.45 (1H, s, H-8), 6.22 (1H, s, H-6), 5.36 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-1??), 4.08~4.11 (1H, m, H-6??), 3.93~3.97 (1H, m, H-6??), 3.21~3.24 (2H, m, H-2??,4??), 3.11~3.19 (2H, m, H-3??,5??), 1.74 (3H, s, 6??-COCH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 177.8 (C-4), 170.3 (C=O, -COCH3), 164.8 (C-7), 161.6 (C-5), 160.5 (C-4?), 157.0 (C-9), 156.8 (C-2), 133.5 (C-3), 131.3(C-2?, 6?), 121.2 (C-1?), 115.5 (C-3?, 5?), 104.3(C-10), 101.5 (C-1??), 99.2 (C-6), 94.2 (C-8), 76.6 (C-3??), 74.5 (C-5??), 74.3 (C-2??), 70.2 (C-4??), 63.2 (C-6??), 20.6 (CH3, -COCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物8為山柰素-3-O-β-D-6?-乙?；拎咸擒?。

化合物9：黃色固體(甲醇)，分子式為C15H10O7。ESI-MS m/z：303.04 ﹢；1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.49 (1H, s, OH-5), 7.68 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-2?), 7.54 (1H, dd, J = 8.5, 2.2 Hz, H-6?), 6.88 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5?), 6.41 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.19 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 176.3 (C-4), 164.4 (C-7), 161.2 (C-9), 156.6 (C-5), 148.2 (C-4?), 147.3 (C-2), 145.5 (C-3?), 136.2 (C-3), 122.4 (C-1?), 120.5 (C-6?), 116.1 (C-5?), 115.6 (C-2?), 103.5 (C-10), 98.7 (C-6), 93.8 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物9為槲皮素。

化合物10：棕黃色固體(甲醇)，分子式為C21H20O11。ESI-MS m/z：449.10 ﹢；1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.65 (1H, s, OH-5), 7.30 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2?), 7.26 (1H, dd, J = 8.3, 2.0 Hz, H-6?), 6.87 (1H, d, J = 8.3 Hz, H-5?), 6.39 (1H, s, H-8), 6.20 (1H, s, H-6), 5.26 (1H, d, J = 1.0 Hz, H-1??), 3.98 (1H, s, H-2??), 3.51 (1H, dd, J = 8.8, 3.1 Hz, H-3??), 3.22 (1H, m, H-5??), 3.15 (1H, t, J = 9.0 Hz, H-4??), 0.82 (3H, d, J = 5.7 Hz, H-6??)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 178.2 (C-4), 164.7 (C-7), 161.7 (C-5), 157.7 (C-9), 156.9 (C-2), 148.9 (C-4?), 145.7 (C-3?), 134.7 (C-3), 121.5 (C-1?), 121.2 (C-6′), 116.1 (C-5?), 115.9 (C-2?), 104.5 (C-10), 102.3 (C-1??), 99.2 (C-6), 94.1 (C-8), 71.6 (C-4??), 71.0 (C-3??), 70.8 (C-2??), 70.5 (C-5??), 17.9 (C-6??)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物10為槲皮苷。

化合物11：棕黃色固體(甲醇)，分子式為C26H28O16。ESI-MS m/z：597.13 ﹢；1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.64 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-2?), 7.62 (1H, dd, J = 2.4, 8.4 Hz, H-6?), 6.86 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5?), 6.35 (1H, s, H-8), 6.16 (1H, s, H-6), 5.50 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-1??), 4.76 (1H, d, J = 6.7 Hz, H-1???)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 177.4 (C-4), 164.0 (C-7), 161.1 (C-5), 156.2 (C-9), 155.3 (C-2), 148.4 (C-4?), 144.8 (C-3?), 133.0 (C-3), 121.9 (C-6?), 121.2 (C-1?), 116.0 (C-5?), 115.2 (C-2?), 104.5 (C-1???), 103.9 (C-10), 98.5 (C-6), 97.9 (C-1??), 93.4 (C-8), 81.8 (C-2??), 77.6 (C-5??), 76.8 (C-3??), 76.1 (C-3???), 73.9 (C-2???), 69.5 (C-4???), 69.3 (C-4??), 65.7 (C-5???), 60.5 (C-6??)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物11為槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃木糖苷。

化合物12：黃色固體(甲醇)，分子式為C21H20O9。ESI-MS m/z：417.11 ﹢；1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.35 (1H, s, H-2),7.94 (1H, d, J = 8.7 Hz, H-5), 7.40 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2?, 6?), 7.00 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6), 6.81 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3?, 5?), 4.82 (1H, d, J = 9.6 Hz, H-1??), 4.03 (1H, s, H-2??), 3.72 (2H, m, H-5??, 3??), 3.29~3.21 (3H, m, H-4??, 6??)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 174.9 (C-4), 161.1 (C-7), 157.2 (C-4?), 157.1 (C-9), 152.6 (C-2), 130.2 (C-2?, 6?), 126.2 (C-5), 123.1 (C-3), 122.5 (C-1?), 116.8 (C-10), 115.0 (C-3?, 5?, 6), 112.7 (C-8), 81.8 (C-5??), 78.8 (C-1??), 73.4 (C-2??), 70.9 (C-3??), 70.5 (C-4??), 61.4 (C-6??)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致，鑒定化合物12為葛根素。

化合物13：棕黃色固體 (甲醇)，分子式為C21H20O9。ESI-MS m/z：417.11 ﹢；1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.40 (1H, s, H-2), 8.05 (1H, d, J = 8.9 Hz, H-5), 7.41 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2?, 6?), 7.24 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-8), 7.15 (1H, dd, J = 8.9, 2.2 Hz, H-6), 6.82 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3?, 5?), 5.11 (2H, d, J = 7.1 Hz, H-1??), 3.72 (1H, m, H-2??), 3.47 (2H, m, H-3??, 5??), 3.35~3.28 (2H, m, H-6??), 3.23~3.13 (1H, m, H-4??)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 174.8 (C-4), 161.4 (C-7), 157.3 (C-9), 153.3 (C-2), 130.1 (C-2?, 6?), 127.0 (C-5), 123.7 (C-3), 122.3 (C-1′), 118.5 (C-10), 115.6 (C-6), 115.0 (C-3?, 5?), 103.4 (C-1??), 100.0 (C-8), 77.2 (C-5??), 76.5 (C-3??), 73.1 (C-2??), 69.6 (C-4??), 60.6 (C-6??)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物13為大豆苷。

聲明：本文所用圖片、文字來源《中國現(xiàn)代中藥》，版權歸原作者所有。如涉及作品內容、版權等問題，請與本網(wǎng)聯(lián)系刪除。

相關鏈接：鼠李糖苷，紫云英苷，甲醇