(4)免疫親和色譜柱的再生與儲存農(nóng)藥殘留免疫親和色譜柱的再生通常采用一定體積的極性有機溶劑(如甲醇等)洗柱，除去非特異性吸附的雜質(zhì)，然后再用10～15倍柱體積的平衡緩沖液沖洗免疫親和色譜柱。在溫和條件下，免疫親和色譜柱可再生使用多次。暫不用使用時，可用含0.02％疊氮化鈉或0.01％硫柳汞的平衡緩沖液平衡色譜柱，于4℃冰箱中保存。

(三)免疫親和色譜技術(shù)在農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用

目前國外已經(jīng)研究開發(fā)了多種農(nóng)藥的免疫親和色譜技術(shù)。Lawrence等(1996)采用免疫親和色譜反相液相色譜聯(lián)用檢測蘿b、玉米、草莓等樣品中殘留的苯基脲類除草劑，檢測靈敏度可達2～5μg／kg，遠低于常規(guī)高效液相色譜的檢測限0.1mg／L 。 David等(1996)將水果提取液中殘留的多菌靈用免疫親和色譜柱凈化濃縮，洗脫液采用高效液相色譜法檢測，檢測限可達0.1μg／kg。Rejeb等(2001)采用免疫親和色譜分離富集小麥、玉米、羊尿等樣品中殘留的咪唑啉酮類除草劑和花生中殘留的噻氟菌胺(thifluzamide)，Spinks等(1999)采用免疫親和色譜分離富集除草劑百草枯，均取得了良好的分離富集和檢測效果。

我國農(nóng)藥免疫親和色譜技術(shù)研究不多，劉曙照等在我國率先建立了克百威(2005)、三唑磷(2006)和氯磺隆(2006)免疫親和色譜高效液相色譜聯(lián)用(IAC-HPLC)技術(shù)，分別用于環(huán)境水、稻米和農(nóng)田土壤中克百威、三唑磷和氯磺隆殘留的分離富集、定性檢測和定量檢測。免疫親和色譜柱容量達1.58～2.6μg／mL柱體積，對目標分析農(nóng)藥的富集倍數(shù)為160～250，回收率為90%～102％，經(jīng)免疫親和色譜分離凈化的樣品中幾乎沒有干擾高效液相色譜檢測的雜質(zhì)，明顯優(yōu)于固相萃取法的分離純化與富集效果。

(四)免疫親和色譜技術(shù)需要進一步解決的問題和發(fā)展方向

在農(nóng)藥殘留分析中，免疫親和色譜主要作為樣品提取液中痕量農(nóng)藥殘留的高效分離富集手段，然后與高效液相色譜、氣相色譜等方法聯(lián)用進行檢測，深受農(nóng)藥殘留分析機構(gòu)和技術(shù)人員的歡迎。

誠然，免疫親和色譜技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用中也存在一些局限性：①作為免疫親和色譜固相基質(zhì)配體的抗體，其本質(zhì)是具有生物活性的免疫球蛋白，對有機溶劑、鹽濃度、pH、溫度等條件的耐受范圍有限，在使用過程中容易失去活性，限制了免疫親和色譜的使用范圍和使用壽命；②目前所使用的免疫親和色譜柱需要有效避免固相基質(zhì)對非目標分析物的非特異性吸附；③免疫親和色譜固定相制備需要較多的純化抗體，面臨較高的成本壓力；④目前已研究開發(fā)的免疫親和色譜固定相耐壓性有限，還難以直接用作高效液相色譜柱進行在線分析。

因此，免疫親和色譜技術(shù)需要進一步解決的問題是：應(yīng)用現(xiàn)代科學技術(shù)，研制能在比較苛刻的條件下保持高免疫活性的抗體；研制無非特異性吸附、耐壓性強、理化性能穩(wěn)定、與配體相容性好的固相基質(zhì)；優(yōu)化配體與基質(zhì)的耦聯(lián)方法，提高免疫親和色譜柱容量；研制免疫親和色譜柱穩(wěn)定劑，延長色譜柱的使用壽命，增加免疫親和色譜柱的重復使用次數(shù)，降低使用成本；使免疫親和色譜從單純的樣品前處理向在線分析方向發(fā)展；將多種抗體或簇特異性抗體固定于固相基質(zhì)，制備多配體或簇特異性免疫親和色譜柱，對多種目標分析組分同時進行分離富集，使單組分免疫親和色譜技術(shù)向多組分免疫親和色譜技術(shù)發(fā)展。

二、分子印跡技術(shù)

(一)分子印跡技術(shù)原理

分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technique，MIT)是以在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點上與目標分析物相匹配、對目標分析物具有選擇性可逆結(jié)合能力的高分子聚合物為受體(也被稱為人工合成抗體)的分離分析技術(shù)。

建立農(nóng)藥分子印跡技術(shù)的基礎(chǔ)是制備對目標分析農(nóng)藥具有選擇性可逆結(jié)合能力的分子印跡聚合物。以目標分析農(nóng)藥分子為模版，設(shè)計、合成或選擇與目標分析農(nóng)藥在分子結(jié)構(gòu)、分子問作用力等方面相匹配的功能單體[如甲基丙烯酸(methylacrylic acid，MAA)、4-MAA)、乙烯基安息香酸等]，將功能單體與模版分子在適當溶劑中結(jié)合形成復合物(如甲基丙烯酸與氯三嗪、4-乙烯基吡啶與2，4-滴、4-乙烯基吡啶與吲哚乙酸、三氟甲基丙烯酸與甲磺隆、乙烯基安息香酸與有機磷農(nóng)藥的復合物等)，然后選擇適當?shù)慕宦?lián)劑[如二甲基丙烯酸乙二醇酯(ethyleneglycol dimethacrylate，EGDMA)、季戊四醇三丙烯酸酯等]，在適當引發(fā)劑[如偶氮二異丁腈(azobisisobtltylnitrile，AIBN)等]引發(fā)下將功能單體相互交聯(lián)起來，使功能單體與模板分子相匹配的功能基團和空間結(jié)構(gòu)得以固定，形成穩(wěn)定的分子印跡聚合物。最后采用強極性溶劑多次萃取、索氏提取器反復回流萃取等方法，將聚合物中的模板分子脫除，這樣就在聚合物上留下了和模板分子在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點相匹配的三維空穴，這樣的空穴能夠重新選擇性地與模板分子結(jié)合。

(二)分子印跡技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀和特點

目前，分子印跡技術(shù)在農(nóng)藥殘留分析中主要用于復雜樣品中目標分析農(nóng)藥的分離、富集與凈化。用針對目標分析農(nóng)藥的分子印跡聚合物制備固相萃取柱，將提取液過柱，樣品中的目標分析農(nóng)藥被選擇性地保留在聚合物的空穴中，然后用少量洗脫劑洗脫目標分析農(nóng)藥，達到選擇性分離、富集和凈化的目的。從柱中洗脫的目標分析農(nóng)藥可采用不同方法進行檢測，實現(xiàn)對復雜樣品中痕量目標分析農(nóng)藥的高靈敏度分析。也有少量應(yīng)用分子印跡聚合物聚合物柱進行在線色譜分離分析的報道。

分子印跡聚合物是人工合成的，具有一定的選擇性識別能力和與高分子物質(zhì)同樣的抗腐蝕、耐高溫、耐有機溶劑等優(yōu)點，因而可應(yīng)用于生物工程、臨床醫(yī)學、環(huán)境監(jiān)測、食品工業(yè)等眾多領(lǐng)域，克服了天然抗體的局限性，在農(nóng)藥殘留分析、特別是脂溶性農(nóng)藥殘留分析中具有明顯的優(yōu)勢。已報道的農(nóng)藥分子印跡技術(shù)研究主要集中于三嗪類除草劑，其他還有2，4-滴、甲磺隆、吲哚乙酸和少數(shù)有機磷殺蟲劑。

分子印跡技術(shù)目前存在的主要問題是，現(xiàn)有分子印跡聚合物的三維空穴與模板分子在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點的契合上還遠達不到抗原抗體結(jié)合的精密程度。因此分子印跡聚合物對目標分析物的識別能力還遠達不到抗體對抗原的特異性識別水平。分子印跡聚合物對非目標分析物的非特異性吸附也是困擾分子印跡技術(shù)應(yīng)用的主要問題之一。

分子印跡技術(shù)的核心是分子印跡聚合物的制備。設(shè)計研制能夠與模板分子精密匹配的功能單體、研究制備自身不產(chǎn)生非特異性吸附的高效交聯(lián)劑、優(yōu)化分子印跡聚合物制備技術(shù)、消除分子印跡聚合物的非特異性吸附是解決分子印跡技術(shù)現(xiàn)存問題的關(guān)鍵。

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