早期，人們曾使用纖維素作為免疫親和色譜的固相基質(zhì)，其較差的耐壓性導(dǎo)致柱流動性差而未被繼續(xù)使用。現(xiàn)在常用的載體有瓊脂糖凝膠、多孔玻璃、高分子涂層硅膠、聚丙烯酰胺凝膠等。

3、免疫親和色譜固相基質(zhì)的活化與耦聯(lián)

大部分免疫親和色譜固相基質(zhì)在與配體(如--抗體)共價耦聯(lián)之前，均需要進行活化。為了使配體能夠突出于固相基質(zhì)表面，可以在配體和固相基質(zhì)之間引入一個“間隔臂”，如可利用戊二醛的兩個醛基分別與基質(zhì)和配體共價連接。通常配體與基質(zhì)的耦聯(lián)方法是先在基質(zhì)骨架上引入親電基團，再與“間隔臂”或抗體上的親核基團(如-NH₂、-OH、-COOH等)共價結(jié)合。

在小配體的免疫親和色譜中，需要在基質(zhì)和配體之間插一個“間隔臂”，以減少空間位阻的影響。在農(nóng)藥殘留免疫親和色譜中，配體是抗農(nóng)藥抗體，分子大，目標分析農(nóng)藥與抗體的結(jié)合一般不會受空間位阻的影響。相反，“間隔臂”的引入、特別是疏水性“間隔臂”的引入反而增加了非特異性吸附的機會。

CNB_r法最早由Axen等(1967)提出，屬經(jīng)典的活化方法，具有方法簡單、活化效果好特點，但是本法有操作CNBr的危險，特別是該法引入了陰離子交換基團異脲衍生物(pK_a=10.4)，成為CNBr活化基質(zhì)增加非特異性吸附的重要原因。CNBr法制備的免疫親和色譜固定相在使用過程可能發(fā)生抗體的流失問題。

Bethell等(1979)建立了目前被認為最優(yōu)良的羰基二咪唑(carbonyldimidazole，CDI活化法。羰基二咪唑法活化與耦聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物只有一個，即N-取代氨基甲酸酯衍生物，反應(yīng)過程較CNBr簡單，活化效率較CNBr法高數(shù)十倍，與抗體的耦聯(lián)率可與CNBr法相媲美。

抗體與活化基質(zhì)的耦聯(lián)分為隨機耦聯(lián)與定向耦聯(lián)兩種方式。

所謂隨機耦聯(lián)，就是指將活化好的基質(zhì)耦聯(lián)在純化抗體的不確定部位。隨機耦聯(lián)存在著一些問題：①基質(zhì)與抗體耦聯(lián)時，抗體的定位不準確，抗原結(jié)合位點容易被占，導(dǎo)致抗體的免疫學活性降低或喪失；②抗體與基質(zhì)多點結(jié)合，使空間位阻加大，阻礙抗原接近結(jié)合位點。所以隨機耦聯(lián)后抗體的活性一般僅為游離抗體的1％～30％。

所謂定向耦聯(lián)，就是選擇性地將抗體的非抗原結(jié)合部位與固相基質(zhì)共價耦聯(lián)。目前，基質(zhì)與抗體定向耦聯(lián)方法主要有3種。①先將蛋白A或蛋白G固定在固相基質(zhì)上，然后再與多抗(或單抗)相結(jié)合。因為蛋白A或蛋白G與IgG有很強的親和力且只與抗體的非抗原結(jié)合部位(IgG的恒定區(qū))結(jié)合，從而可使抗體的抗原結(jié)合位點游離。該法的缺點是蛋白A或蛋白G與抗體的結(jié)合是非共價結(jié)合，作為配體的抗體在色譜過程中容易受條件影響而流失。②先將抗體或抗體F舳片段用13一巰基乙醇還原，使抗體的鉸鏈區(qū)打開，生成自由的巰基，然后與含碘乙?；鶊F的基質(zhì)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的硫醚鍵而耦聯(lián)于基質(zhì)上。抗體的抗原結(jié)合部位不含巰基，耦聯(lián)后不影響抗體的抗原結(jié)合部位，但還原后的抗體其穩(wěn)定性會受到一定影響。③將抗體恒定區(qū)糖類中的羥基在溫和條件下用高碘酸鹽氧化，或?qū)⒛┒税肴樘菤埢c半乳糖氧化酶反應(yīng)，形成醛基后與含酰肼的基質(zhì)耦聯(lián)。定向耦聯(lián)的優(yōu)點是不影響抗體的抗原結(jié)合位點，可保持抗體的高免疫學活性，提高免疫親和色譜柱的親和容量。

4、免疫親和色譜柱的制備

將抗體與固相基質(zhì)的耦聯(lián)物(免疫親和色譜固定相或稱為免疫吸附劑)加在適當緩沖液中，輕輕搖勻后加至底部有篩板的玻璃柱或聚乙烯柱中，讓免疫吸附劑自然沉降，打開柱出口，用緩沖液平衡后關(guān)閉柱出口。

5、免疫親和色譜柱性能評價與免疫親和色譜條件的選擇

(1)免疫親和色譜柱容量的測定：柱容量是免疫親和色譜中具有重要實用價值的參數(shù)，分為動態(tài)柱容量(μg/mL柱床)和絕對柱容量(μg/mg IgG)。在免疫親和色譜條件已經(jīng)確定的情況下，測定柱容量最方便的方法是將一定濃度、超過理論容量的目標分析物溶液通過免疫親和色譜柱，待柱飽和(出柱濃度與人柱濃度相同)后，洗滌去除柱內(nèi)游離物，用適當溶劑完全洗脫目標分析物，測定其含量，從而可計算出柱容量。免疫親和色譜柱在使用和儲存過程中應(yīng)定期檢測柱容量的變化。

(2)吸附與洗滌介質(zhì)的選擇：將一系列不同pH、不同離子強度及不同化學組成的緩沖液分別用作平衡免疫親和色譜柱、分離富集目標分析物和洗滌免疫親和色譜柱的流動相，測定不同條件下的柱容量，選擇柱容量最大的緩沖液作為平衡免疫親和色譜柱、分離富集目標分析物和洗滌免疫親和色譜柱的流動相。

(3)洗脫條件的選擇：免疫親和色譜柱中的目標分析物的洗脫可采用不同方法，如改變緩沖液的pH、離子強度、極性，或使用變性劑(脲、胍等)、去垢劑和離子序列高的離子配制洗脫劑。對于農(nóng)藥小分子，常采用在緩沖液中加入適當能與水互融的有機溶劑(如甲醇等)作洗脫劑，洗脫液可直接用于高效液相色譜儀或氣相色譜儀分析。在樣品提取液中雜質(zhì)含量高的情況下，為了提高免疫親和色譜的效率，有時需要在免疫親和色譜分離凈化和富集前適當增加凈化步驟，以去除樣品提取液中的大量雜質(zhì)。

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