經(jīng)典的農(nóng)藥殘留分析主要依靠色譜、色譜質(zhì)譜聯(lián)用等理化分析技術(shù)，需要訓(xùn)練有素的分析技術(shù)人員、專業(yè)化的實(shí)驗(yàn)室和儀器設(shè)備，分析樣品的制備過程相對(duì)復(fù)雜，分析時(shí)間長、成本高，難以適應(yīng)大量樣品和現(xiàn)場(chǎng)樣品快速檢測(cè)的要求。為適應(yīng)農(nóng)副產(chǎn)品的產(chǎn)地源頭監(jiān)控、鮮活農(nóng)副產(chǎn)品交易現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)和進(jìn)出口農(nóng)副產(chǎn)品的檢測(cè)時(shí)效，需要研究開發(fā)快速高效的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法。隨著生命科學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、新材料等學(xué)科的發(fā)展和交融，分析化學(xué)從經(jīng)典的物理化學(xué)分離分析發(fā)展到復(fù)雜體系中的分子識(shí)別，檢測(cè)靈敏度已進(jìn)入了單個(gè)分子的水平。以生物分析化學(xué)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)，如酶活性抑制分析、免疫分析、生物傳感器等，以其簡便快速、特異靈敏、樣品用量少、成本低廉、不需要貴重儀器等優(yōu)勢(shì)，成為20世紀(jì)后期以來農(nóng)藥殘留分析領(lǐng)域的一個(gè)重要發(fā)展方向。

應(yīng)用酶活性抑制分析、酶聯(lián)免疫吸附分析、金標(biāo)免疫色譜、生物傳感器、生物芯片等現(xiàn)代生物分析技術(shù)測(cè)定農(nóng)藥殘留，對(duì)大量樣本進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速篩查定性分析和初步定量分析，必要時(shí)對(duì)初篩呈陽性或有疑問的樣品再用色譜、波譜等經(jīng)典的理化方法進(jìn)行確證，可大大提高檢測(cè)效率和降低檢測(cè)成本。采用酶活性抑制分析、免疫分析等現(xiàn)代生物分析技術(shù)快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留，提高其穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度，并逐步使方法標(biāo)準(zhǔn)化，是國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)工作者為之努力的目標(biāo)和研究熱點(diǎn)之一。

有機(jī)磷酸酯和氨基甲酸酯是兩類重要的有機(jī)合成農(nóng)藥，一直是農(nóng)副產(chǎn)品尤其是果蔬中農(nóng)藥殘留的主要檢測(cè)對(duì)象之一。果蔬是比較特殊的農(nóng)產(chǎn)品，許多蔬菜(如葉菜)的生長和收獲期短，生長季節(jié)病蟲害防治引起的農(nóng)藥殘留問題較多，成為農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)控的重點(diǎn)。但蔬菜(特別是葉菜)的保鮮期很短，如采用常規(guī)色譜、波譜和色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)，沒等檢測(cè)完畢，蔬菜就已經(jīng)失去了食用價(jià)值。因此用于快速檢測(cè)蔬菜等農(nóng)副產(chǎn)品中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的酶活性抑制技術(shù)及其產(chǎn)品被廣泛研究和開發(fā)利用。

一、酶活性抑制分析法概述

Giang與Hall(1951)利用有機(jī)磷酸酯農(nóng)藥、Zweig和Archer(1958)利用氨基甲酸酯類農(nóng)藥在體外對(duì)乙酰膽堿酯酶(acetylcholine est。erase，AChE)具有抑制作用的原理，通過測(cè)定乙酰膽堿酯酶催化水解乙酰膽堿產(chǎn)生乙酸的量(ApH)來衡量酶活性被抑制的程度，對(duì)敵敵畏、速滅磷、甲萘威等農(nóng)藥進(jìn)行定量測(cè)定。Kramer與Gamsorl(1958)以乙酸膽堿的類似物靛酚乙酸酯作乙酰膽堿酯酶的底物，通過比色測(cè)定乙酰膽堿酯酶催化水解靛酚乙酸酯所產(chǎn)生的藍(lán)色的靛酚的量，可檢出1～10μg的多種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類化合物，該方法成為后來采用比色法對(duì)有機(jī)磷氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行測(cè)定的基礎(chǔ)。1968年，Mendoza等將薄層色譜與酶活性抑制法相結(jié)合，通過在薄層板上分離和顯色來測(cè)定10種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥，最小檢出量可達(dá)到ng水平，有較好的重現(xiàn)性，后來成為一種經(jīng)典的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥測(cè)定法被廣泛采用。20世紀(jì)80年代，人們開始以來源豐富、取材和制備都十分方便的植物酯酶代替動(dòng)物酶源，建立薄層色譜植物酯酶活性抑制分析法，為酶活性抑制分析法的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用開拓了新空間。20世紀(jì)90年代以來，國內(nèi)外以酶活性抑制分析法為基礎(chǔ)，先后開發(fā)出測(cè)定有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的快速測(cè)定試劑、速測(cè)卡和速測(cè)儀，酶活性抑制分析法仍然是我國目前現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)蔬菜等農(nóng)副產(chǎn)品中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的主要方法。

二、酶活性抑制分析法原理

有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥都是神經(jīng)毒劑，對(duì)昆蟲、哺乳動(dòng)物(包括人體)神經(jīng)傳遞過程中具有重要作用的乙酰膽堿酯酶具有強(qiáng)烈的抑制作用。當(dāng)乙酰膽堿酯酶活性被抑制時(shí)，該酶對(duì)在神經(jīng)傳導(dǎo)過程中起重要作用的乙酰膽堿的水解不能正常進(jìn)行，從而導(dǎo)致酶的底物乙酰膽堿的積累，影響動(dòng)物正常的神經(jīng)傳導(dǎo)，引起神經(jīng)中毒甚至導(dǎo)致死亡。酶活性抑制法快速檢測(cè)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留就是利用這一神經(jīng)毒理學(xué)原理來實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)被測(cè)樣品提取液中不含或含有很少量的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥時(shí)，乙酰膽堿酯酶的活性就不被抑制或僅被輕微抑制，酶的底物乙酰膽堿就能夠被水解或大部分被水解，水解產(chǎn)物與加人體系中的顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)，可通過比色法進(jìn)行測(cè)定。如果試樣提取液中含有一定量的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥，酶的活性就會(huì)受到抑制或部分抑制，試樣中加入的酶的底物就不能被酶水解或部分水解，從而不顯色或顯色很淺，用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值，以不含有機(jī)磷或氨基甲酸酯類的農(nóng)藥為對(duì)照，計(jì)算酶活性被抑制的百分率。抑制百分率與有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的濃度在一定范圍內(nèi)呈正比，據(jù)此對(duì)有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行定性測(cè)定和定量測(cè)定。

羧酸酯酶(非特異性酯酶的一種)與乙酰膽堿酯酶類似，均以絲氨酸殘基作為活性中心，因此對(duì)乙酰膽堿酯酶有抑制作用的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)羧酸酯酶也有抑制作用，因此依據(jù)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)羧酸酯酶活性抑制作用的有無或大小，也可以對(duì)有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行定性測(cè)定和定量測(cè)定。

酶活性抑制法檢測(cè)有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的基本原理見圖6—1。

近年來，商品化酶活性抑制法檢測(cè)產(chǎn)品(如酶片、酶標(biāo)簽、速測(cè)箱等)大多是建立在上述顯色反應(yīng)基礎(chǔ)上的，但是除了有機(jī)磷和氨基甲酸酯類物質(zhì)有可能對(duì)乙酰膽堿酯酶活性產(chǎn)生抑制作用外，某些氯代煙堿類似物對(duì)乙酰膽堿酯酶也有一定的抑制作用，因此檢測(cè)過程中需要注意由此引起的假陽性現(xiàn)象。

參考資料：農(nóng)藥殘留分析