“曲乃酒之骨”，醬香型高溫大曲在發(fā)酵條件下富集了豐富的功能微生物，在生產(chǎn)過程中為整個(gè)醬酒釀造體系提供了微生物、酶系、風(fēng)味及其前體物。高溫放線菌是一類革蘭氏陽性、化能異養(yǎng)的微生物類群，能夠在極端環(huán)境下生存和繁殖，能代謝產(chǎn)生酯化酶、淀粉酶、磷酸酶等多種酶和風(fēng)味及其前體物。該菌在醬香型白酒釀造體系中屬于一類具有重要應(yīng)用潛力的微生物資源，其在白酒釀造體系中的功能尚不清楚。本課題組在前期研究中也成功建立了一種從醬香大曲中分離、篩選高溫放線菌的方法，從醬香型大曲中分離鑒定了多株高溫放線菌，證實(shí)這些菌株具有良好的產(chǎn)吡嗪風(fēng)味組分能力，并對其代謝產(chǎn)吡嗪的途徑及機(jī)理進(jìn)行解析。

近日，基于課題組前期的工作，貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院對醬香型高溫大曲中的高溫放線菌進(jìn)行分離篩選，結(jié)合多相分類學(xué)技術(shù)進(jìn)行菌株鑒定，并利用第二代Illumina和第三代PacBio結(jié)合的測序技術(shù)對所篩選菌株進(jìn)行全基因組測序，從基因組層面解析其潛在的代謝功能特性，分析該菌株代謝典型風(fēng)味組分的潛在機(jī)理，旨在為今后繼續(xù)深入解析高溫放線菌類群微生物產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)，特別是四甲基吡嗪的生物合成代謝途徑及機(jī)理提供參考。

1 菌株分離篩選及鑒定

1.1 菌株的形態(tài)學(xué)特征

從醬香高溫大曲中分離得到1 株純種菌株FBKL4.014，根據(jù)菌落形態(tài)特征初步判斷其可能歸屬于高溫放線菌。

菌株宏觀形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，該菌株長勢良好，在培養(yǎng)基正反兩面表現(xiàn)出的生長趨勢不同，菌落總體呈缺刻圓狀、突起、有較多皺褶、質(zhì)地干燥致密，基內(nèi)菌絲呈淺黃色，氣生菌絲呈乳白色且較為發(fā)達(dá)，無可溶性色素產(chǎn)生，該菌株的菌落形態(tài)具有高溫放線菌培養(yǎng)的典型特征。高溫放線菌FBKL4.014的微觀形態(tài)特征如圖1B所示，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》分析，發(fā)現(xiàn)其菌絲體較短，形狀不一且黏在一起呈簇狀，呈圓球形的分生孢子直接著生于菌絲體上，分布于菌絲體兩側(cè)，其中有分支的孢子梗長度較短。

1.2 菌株的最適生長溫度

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株FBKL4.014在45～50 ℃條件下生長最旺盛，在55～60 ℃高溫范圍內(nèi)仍能夠緩慢生長，37 ℃時(shí)該菌株能正常生長，但在30 ℃時(shí)不生長。Wang Xueshan等和顏林春的研究表明高溫放線菌屬大多可以生長在最高溫度可達(dá)60～65 ℃的高溫發(fā)酵環(huán)境中，因此，菌株FBKL4.014在耐熱性方面與高溫放線菌具有很高的相似度，而這也與其分離環(huán)境——醬香大曲的高溫發(fā)酵環(huán)境密切相關(guān)。

1.3 菌株的生理生化特征

生理生化分析表明，高溫放線菌FBKL4.014為革蘭氏陽性菌，該菌株可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，并能使牛奶凝固但不胨化，使明膠產(chǎn)生液化現(xiàn)象，同時(shí)該菌株能水解淀粉和纖維素，由此推測該菌株能夠代謝產(chǎn)生淀粉酶和纖維素酶，具備將大分子原料降解為可發(fā)酵性糖的潛能，有助于推動整個(gè)釀造過程的順利進(jìn)行。碳源利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株能夠有效利用葡萄糖、海藻糖、D-棉子糖、D-甘露醇和D-山梨醇等碳源進(jìn)行生長代謝，對麥芽糖表現(xiàn)出弱利用特征，不能利用乳糖和肌醇兩種碳源。此外，該菌株能夠利用硫酸銨和磷酸氫二銨兩種無機(jī)氮源和酪氨酸，對尿素表現(xiàn)出弱利用性，不能利用脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酸和甘氨酸。

1.4 菌株16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

高溫放線菌FBKL4.014基因組DNA片段長度約23 kb，經(jīng)PCR擴(kuò)增、拼接后的16S rDNA序列有效片段長度約為900 bp，與GenBank、EzTaxon等數(shù)據(jù)庫中相似菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對分析，并在種分類學(xué)水平搜索序列相似性，結(jié)果顯示菌株FBKL4.014與萊斯氏屬下糖萊斯氏菌（Laceyella sacchari）序列相似性最高；通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)高溫放線菌FBKL4.014與L. sacchari JF819833聚類在同一個(gè)分支上，其序列同源性為99.78%，因此判斷該菌株在種水平上極有可能為L. sacchari。

2 L.sacchari FBKL4.014全基因組結(jié)果分析

2.1 菌株FBKL4.014基因組的一般特征

L. sacchari FBKL4.014基因組信息已上傳NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中，登錄號為CP103866.1。對Illumina NovaSeq和PacBio Sequel下機(jī)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合拼裝，得到完整的基因組序列。L. sacchari FBKL4.014基因組序列全長3.35 Mb，GC含量為48.67%，共預(yù)測到3 328 個(gè)蛋白編碼基因，包括97 個(gè)tRNA、31 個(gè)rRNA（10 個(gè)5S rRNA、11 個(gè)16S rRNA、10 個(gè)23S rRNA）和36 個(gè)ncRNA編碼基因，預(yù)測到11 條CRISPRs結(jié)構(gòu)，測序深度為433×。利用CGView軟件繪制了FBKL4.014基因組圈圖。此外，通過NCBI平臺查閱到其他糖萊西氏菌的GC含量大多在47%～49%之間，與本研究菌株所測得的GC含量（48.67%）接近，進(jìn)一步證實(shí)該菌符合高溫放線菌菌屬GC含量低的特征。

2.2 菌株FBKL4.014基因組功能注釋結(jié)果

利用BLAST在線比對分析工具將FBKL4.014的測序結(jié)果分別與NR、直系同源蛋白分組比對（eggNOG）、KEGG、Swiss-Prot、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，獲取注釋到的蛋白編碼基因數(shù)量分別為3 325、2 580、1 649、2 301、2 150 個(gè)和2 497 個(gè)；其中，在TCDB和PHI數(shù)據(jù)庫中注釋到的基因數(shù)較少，分別為474 個(gè)和553 個(gè)。此外，在CAZy和CARD數(shù)據(jù)庫中分別注釋到72 條和56 條基因信息。

2.3 eggNOG（COG）數(shù)據(jù)庫基因注釋分析

eggNOG（COG）數(shù)據(jù)庫的比對分析結(jié)果顯示， 在 數(shù) 據(jù) 庫 的 所 有2 5 個(gè) 功 能 分 類中， FBKL4.014共有19 類2 580 個(gè)基因得到了注釋，占注釋基因總數(shù)的77.52%。其中具有潛在生物學(xué)功能的基因注釋結(jié)果最為豐富，共721 個(gè)，占注釋基因總數(shù)的27.95%，這也為今后針對高溫放線菌未知基因組信息的進(jìn)一步挖掘提供可能。其次，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝存在215 個(gè)注釋結(jié)果，占注釋基因總數(shù)8.33%；有研究表明醬香大曲中氨基酸代謝的活躍程度總體較高，釀酒原料中含有豐富的蛋白質(zhì)，微生物通過氨基酸代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)途徑分解原料中的蛋白質(zhì)，不僅可以為微生物生長提供必須的能量物質(zhì)，也可以為酒體提供風(fēng)味及其前體物。結(jié)合課題組前期的工作，這一研究結(jié)果的發(fā)現(xiàn)也說明在發(fā)酵體系中菌株FBKL4.014可能與醬香型白酒中含氮化合物的形成密切相關(guān)。

2.4 GO數(shù)據(jù)庫基因注釋分析

GO數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果表明，菌株基因組共有2 150 個(gè)蛋白編碼基因得到注釋，占注釋基因總數(shù)的64.60%。在GO數(shù)據(jù)庫生物過程、細(xì)胞組成、分子功能三大功能分類數(shù)據(jù)庫中，生物過程、細(xì)胞氮化合物代謝過程、生物合成過程和小分子代謝過程這4 個(gè)途徑富集的基因數(shù)量最多，分別富集到2 030、789、753 個(gè)和579 個(gè)基因。有研究表明，在醬香型白酒高溫釀造體系下，隨著發(fā)酵溫度升高，大曲中微生物豐度隨之降低，因此以菌株FBKL4.014為代表的一類嗜熱菌的正常生物合成和代謝活動對推動醬香型白酒整體釀造進(jìn)程意義重大，尤其是細(xì)胞氮復(fù)合代謝過程富集到較多的基因，也與前期該菌株能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽以及利用硫酸銨和磷酸氫二銨等無機(jī)氮源的研究結(jié)果高度相關(guān)，初步揭示該菌株具有將無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為如游離氨等某些含氮風(fēng)味物質(zhì)前體物的潛力。碳水化合物代謝過程和分解代謝過程也分別富集了113 個(gè)和272 個(gè)基因，表明該菌株可能參與到釀酒原料中淀粉、纖維素及其他有機(jī)大分子物質(zhì)的分解代謝過程，是酒體中風(fēng)味及其前體物的潛在來源。此外，細(xì)胞、細(xì)胞組成、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)4 個(gè)途徑分別富集到686、523、510 個(gè)和396 個(gè)基因；分子功能、離子結(jié)合和DNA結(jié)合3 個(gè)途徑也分別富集到1968、690 個(gè)和336 個(gè)基因。

2.5 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋分析

KEGG數(shù)據(jù)庫中FBKL4.014共有1 649 個(gè)蛋白編碼基因注釋到8 個(gè)層級的205 條通路中，占基因總數(shù)的49.55%。分析結(jié)果表明代謝途徑富集到的基因數(shù)量最多，共1 085 個(gè)，其中有19 個(gè)較為完整的代謝途徑，總體上表現(xiàn)出氨基酸代謝活動較為活躍的結(jié)果。 

進(jìn)一步通過KEGG數(shù)據(jù)庫氨基酸代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)菌株具備丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸、色氨酸和蘇氨酸等19 種氨基酸代謝途徑。對氨基酸代謝通路的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，天冬氨酸、絲氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酸和天冬酰胺可由糖類物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化而成，丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸既可以由糖類物質(zhì)生物合成，也可以由前述的6 種氨基酸通過生物轉(zhuǎn)化合成。從FBKL4.014注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)、亮氨酸、精氨酸、賴氨酸和酪氨酸只能通過相應(yīng)氨基酸生物轉(zhuǎn)化而不能由糖類物質(zhì)合成，這與張巧玲等的研究結(jié)果一致。氨基酸代謝在白酒釀造體系中極為重要，主要表現(xiàn)在3 個(gè)方面：一方面氨基酸是醬香型白酒中風(fēng)味前體物的重要來源，可代謝產(chǎn)生相應(yīng)的醇類物質(zhì)作為酒體中酸類和酯類物質(zhì)形成的重要前體，如亮氨酸代謝生成異戊醇、異亮氨酸代謝產(chǎn)生活性戊醇、酪氨酸代謝產(chǎn)生酪醇、纈氨酸代謝產(chǎn)生異丁醇、苯丙氨酸代謝產(chǎn)生2-苯乙醇等。另一方面氨基酸本身就是醬香型白酒中風(fēng)味物質(zhì)的直接來源，通過代謝產(chǎn)生內(nèi)酯、大馬士酮和香葉基內(nèi)酮等風(fēng)味物質(zhì)。第三氨基酸與還原糖在高溫條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)生成呋喃類衍生物、吡咯類衍生物和醛酮及吡嗪類衍生物。因此，菌株FBKL4.014 KEGG注釋分析結(jié)果也初步表明其在醬酒釀造體系中可能與一些含氮風(fēng)味組分的產(chǎn)生密切關(guān)聯(lián)。

FBKL4.014基因組中GH15家族的葡萄糖淀粉酶（EC 3.2.1.3）是水解淀粉的主要酶，在白酒釀造中可將原料中的淀粉水解為葡萄糖，一方面葡萄糖為酵母菌、細(xì)菌等微生物生長代謝提供營養(yǎng)物質(zhì)和能量，推動發(fā)酵過程的進(jìn)行；另一方面葡萄糖經(jīng)糖酵解、三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝等途徑產(chǎn)生氨基酸、有機(jī)酸等酒體風(fēng)味及風(fēng)味前體物。此外，GH3家族的β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）是纖維素降解的關(guān)鍵酶，通過水解纖維素非還原末端β-D-糖苷鍵形成葡萄糖。這也進(jìn)一步證實(shí)了前期菌株生理生化特征有關(guān)菌株能產(chǎn)淀粉酶和纖維素酶的推測?？傊瑥腃AZy分析角度對菌株FBKL4.014降解淀粉、纖維素等碳水化合物能力的明確，再次表明高溫放線菌類群在推動醬香型白酒釀造順利進(jìn)行的過程中具有一定的潛在作用。

2.6 FBKL4.014四甲基吡嗪合成相關(guān)基因分析

白酒釀造體系中的四甲基吡嗪可通過微生物代謝產(chǎn)生，乙偶姻和游離氨是其關(guān)鍵前體物。因此四甲基吡嗪的代謝可分為兩部分：1）吡嗪半環(huán)碳骨架化合物的合成；2）吡嗪含氮基團(tuán)結(jié)構(gòu)的形成。一方面，釀酒原料中的糖類物質(zhì)在微生物作用下，經(jīng)糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas，EMP）途徑產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸通過乙酰乳酸合酶（EC 2.2.1.6）轉(zhuǎn)化為α-乙酰乳酸，隨后通過乙酰乳酸脫羧酶（acetolactate decarboxylase，ALDC）脫羧轉(zhuǎn)化為乙偶姻（半環(huán)碳骨架化合物）；另一方面，蛋白質(zhì)被蛋白酶水解成游離氨基酸，經(jīng)氨基酸代謝進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為游離態(tài)氨（含氮基團(tuán)）；半環(huán)碳骨架化合物和含氮基團(tuán)通過非酶促反應(yīng)生成四甲基吡嗪。

3 結(jié)論

從醬香型高溫大曲中篩選到1 株高溫放線菌FBKL4.014，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征、16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定，確定其可能為高溫放線菌科、萊斯氏菌屬下的L. sacchari。同時(shí)，利用第2代和第3代結(jié)合的測序技術(shù)完成L. sacchari FBKL4.014基因組測序工作，測序結(jié)果表明，L. sacchari FBKL4.014染色體基因組序列全長3.35 Mb，GC含量48.67%，測序深度433×，共預(yù)測到3 328 個(gè)蛋白編碼基因，為后續(xù)進(jìn)一步對其進(jìn)行功能性研究提供數(shù)據(jù)支持，同時(shí)希望為醬香型白酒釀造體系中其他未培養(yǎng)微生物篩選方法提供參考。

通過全基因組測序及基因組解析，發(fā)現(xiàn)了L. sacchari FBKL4.014基因組上葡萄糖淀粉酶（EC 3.2.1.3）、β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）等碳水化合物活性酶編碼基因的存在，證實(shí)其可能為該菌株參與釀酒原料中碳水化合物分解代謝的關(guān)鍵證據(jù)。KEGG數(shù)據(jù)庫注釋分析結(jié)果進(jìn)一步顯示該菌株基因組中有較完整的氨基酸代謝途徑，說明該菌株氨基酸代謝活動也可能非常活躍；醬香型白酒中含氮化合物高是其典型的風(fēng)格特征，其中，細(xì)胞氮復(fù)合代謝過程可能是該菌株將環(huán)境中的無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為某些風(fēng)味前體物的關(guān)鍵途徑，無疑表明菌株FBKL4.014很可能也是醬香型白酒中含氮物質(zhì)的重要微生物來源。此外，該菌株基因組中還存在四甲基吡嗪合成的關(guān)鍵酶編碼基因，同時(shí)針對ALDC和2,3-BDH尚未在該菌株基因組中被發(fā)現(xiàn)的事實(shí)，推測該菌株可能存在尚未被發(fā)現(xiàn)的特殊的四甲基吡嗪生物合成完整途徑，也為今后醬香型白酒中風(fēng)味組分在高溫放線菌中的生成機(jī)理研究提供了基因?qū)用娴臄?shù)據(jù)支持。本研究有助于發(fā)掘醬香大曲中高溫放線菌的功能應(yīng)用價(jià)值，為后續(xù)高溫放線菌功能特性的確定與資源挖掘奠定了基礎(chǔ)。

相關(guān)鏈接：高溫放線菌，蘇氨酸，萊西氏菌，磷酸氫二銨，嗜熱菌，β-葡萄糖苷酶，硫酸銨，偉業(yè)計(jì)量

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