β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）是一類作用于β-1,4-甘露糖苷鍵的內(nèi)切水解酶，廣泛分布于軟體動(dòng)物、植物和微生物中，其中微生物來(lái)源的甘露聚糖酶資源最為豐富。作為一種新興的食品加工用酶，甘露聚糖酶可應(yīng)用在寡糖的制備、面包品質(zhì)的改良、乳制品增稠加工及果汁飲料穩(wěn)定性等領(lǐng)域。目前，GH5家族和GH26家族來(lái)源的甘露聚糖酶被進(jìn)行了廣泛研究，而另外兩個(gè)家族，尤其是GH134家族甘露聚糖酶報(bào)道的信息較少。本課題組前期探究了GH5家族甘露聚糖酶NsMan5B對(duì)果汁澄清效果的評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)除橘子汁外，該重組酶對(duì)其他果汁的澄清度都有不同程度的提高，其中柿子汁澄清度提高了31.8%，蘋果汁、桃汁、葡萄汁的澄清度分別提高7%、4%和4%。而關(guān)于GH134家族的甘露聚糖酶在果汁加工的應(yīng)用還鮮有相關(guān)報(bào)道。

近日，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院擬對(duì)嗜熱真菌小孢根霉（Rm）HBFH10中GH134家族甘露聚糖酶基因進(jìn)行克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)的研究，探究其在果汁加工過(guò)程中的應(yīng)用潛力。

1 嗜熱菌HBFH10的分離及鑒定

從河北省鳳來(lái)儀酒業(yè)有限公司大曲中篩選獲得1 株真菌HBFH10，由A、B經(jīng)菌株生長(zhǎng)溫度測(cè)定結(jié)果可知，菌株HBFH10在19 ℃下無(wú)法正常生長(zhǎng)，而能夠在45 ℃條件下正常生長(zhǎng)，符合嗜熱真菌生長(zhǎng)溫度特點(diǎn)要求，判定HBFH10菌為嗜熱真菌。使用ITS1和ITS4引物進(jìn)行18S基因間隔區(qū)域的擴(kuò)增，最終獲得800 bp左右PCR產(chǎn)物。利用BLAST軟件分析發(fā)現(xiàn)與Rm strain D4-1（GQ502280.1）一致性最高，為99%，通過(guò)進(jìn)化樹分析菌株HBFH10屬于Rm，最終將該菌命名為Rm HBFH10。

2 甘露聚糖酶RmMan134基因序列分析

經(jīng)對(duì)多條GH134氨基酸序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，該家族甘露聚糖酶存在2 個(gè)保守區(qū)域。保守I區(qū)序列（NFGIFKQNW），活性催化位點(diǎn)位于該區(qū)域中，該區(qū)域結(jié)構(gòu)主要為L(zhǎng)oop結(jié)構(gòu)，由于Loop結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的柔性特點(diǎn)，這為底物的識(shí)別及催化提供了便利；保守II區(qū)序列（DDTRFWVD），該區(qū)域相對(duì)而言最為保守，該區(qū)域主要是β折疊片結(jié)構(gòu)。在上述兩區(qū)域設(shè)計(jì)GH134家族的兼并引物。本研究利用兼并引物Man134UF和Man134UR對(duì)Rm HBFH10基因組DNA進(jìn)擴(kuò)增，獲得1 個(gè)基因保守片段，測(cè)序結(jié)果表明該基因?yàn)镚H134家族的甘露聚糖酶基因的部分序列，并且與菌株Rm ATCC 52813基因組中的假使蛋白基因（CEG81741.1）序列一致性為98%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)RmMan134基因由552 bp堿基組成，沒(méi)有內(nèi)含子序列，編碼183 個(gè)氨基酸和1 個(gè)終止密碼子。

RmMan134基因與已報(bào)道的GH134家族甘露聚糖酶的一致性對(duì)比分析，該基因與已報(bào)道GH134家族基因的氨基酸序列一致性較低（＜69.6%），表明RmMan134基因具有一定的新穎性，具有理論研究?jī)r(jià)值。其中與甘露聚糖酶AoMan134（XP_023093135.1）一致性為45.2%，與甘露聚糖酶SsMan134（PDB，5JTS）一致性為51.6%，與甘露聚糖酶RmMan134A（MF538624）一致性為69.6%，與甘露聚糖酶AnMan134（ANID_02710）一致性為51%。RmMan134具有α/β結(jié)構(gòu)，屬于Clan-A超家族，含有催化保守氨基酸（E55和D67），分別位于第2個(gè)和第3個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)中。

3 重組菌RmMan134基因誘導(dǎo)表達(dá)及產(chǎn)物的SDSPAGE分析

表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k-RmMan134經(jīng)Bgl II限制酶線性化后，電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，在MD平板上培養(yǎng)，挑取48 個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行小管誘導(dǎo)，畢赤酵母采用兩段法進(jìn)行異源基因誘導(dǎo)表達(dá)。從48 個(gè)轉(zhuǎn)化子中篩選得到32 株具有甘露聚糖酶活力的轉(zhuǎn)化子。將重組菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)之后，對(duì)細(xì)胞發(fā)酵液進(jìn)行酶活力檢測(cè)，發(fā)酵液中酶活力為7.8 U/mL。發(fā)酵酶液800 mL經(jīng)12 000×g離心10 min去除酵母細(xì)胞及培養(yǎng)基，收集上清液，之后將上清酶液進(jìn)行膜包（10 kDa）濃縮處理，使?jié)饪s后的酶液為30 mL左右。如SDS-PAGE檢測(cè)重組酶RmMan134表觀分子質(zhì)量約為22 kDa，比理論分子質(zhì)量18.5 kDa偏大，經(jīng)糖基化預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)RmMan134酶蛋白分子存在1 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（NKSG）。

4 重組菌RmMan134酶學(xué)特性分析

重組酶 RmMan134的最適反應(yīng)溫度為 5 0 ℃，該酶的反應(yīng)溫度范圍較廣，30～80 ℃都能夠檢測(cè)到該酶活力，在70 ℃反應(yīng)下具有30%以上酶活力，在80 ℃時(shí)能夠維持20%以上活力。

重組酶RmMan134具有較廣的pH值作用范圍，在pH 2.0～11.0范圍內(nèi)都表現(xiàn)出一定的酶活力，該酶的最適反應(yīng)pH 6.0，在酸性范圍內(nèi)（3.0＜pH＜7.0）酶活力較高，能夠維持60%以上酶活力。隨著pH值的逐漸升高，酶活力也隨之降低。

分析重組酶 RmMan134的熱穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，在50 ℃條件下，重組酶RmMan134處理1 h后，能夠維持60%以上酶活力；而60 ℃處理1 h后，酶活力損失約60%。分析其pH值耐受性發(fā)現(xiàn)，該酶在pH 4.0～8.0范圍內(nèi)處理1 h后酶活力基本維持穩(wěn)定，即使在堿性條件下（7.0＜pH＜11.0）依然能夠維持75%以上酶活力，而在強(qiáng)堿條件下，重組酶極不穩(wěn)定，酶活力喪失較明顯。

將重組酶RmMan134對(duì)角豆膠活性定義為100%，則對(duì)底物魔芋膠、果膠、CMC-Na和木聚糖的活力分別為114.8%、44.9%、7.2%和19.6%。以魔芋膠為底物時(shí)，設(shè)定底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)（1/[S]）為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)速率倒數(shù)（1/V）為縱坐標(biāo)，獲得雙倒數(shù)曲線：Y=0.0116X＋0.0175，R2=0.998，計(jì)算酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)V max為57.1 μmol/（min·mg），Km為0.66 mg/mL。

5 重組菌RmMan134對(duì)5種果汁的影響

除了杏汁和葡萄汁外，重組酶RmMan134對(duì)其他果汁的澄清度都有不同程度的提高，其中橙汁提高的最為明顯，提高了23.8%。其次蘋果汁提高了11%，桃汁提高了7%左右。在酶解杏汁和葡萄汁時(shí)，很有可能是杏汁和葡萄汁中的單寧及多酚物質(zhì)與重組酶RmMan134交聯(lián)在一起，影響了果汁的澄清度。除此之外，重組甘露聚糖酶的添加使得葡萄汁出汁率提高了7%左右，而重組酶并未增加上述5 種水果的總還原糖量。

6 討論

本研究成功從濃香大曲中篩選獲得了1 株嗜熱真菌HBFH10，經(jīng)鑒定為Rm。目前，微孢根霉菌種在食品生產(chǎn)中起著重要作用，已從Rm中獲得了淀粉酶、植酸酶酶和脂肪酶等。本研究從嗜熱真菌Rm HBFH10中克隆得到一個(gè)新的甘露聚糖酶基因（RmMan134）。

甘露聚糖酶分為GH5、GH26、GH113和GH134家族，GH113家族甘露聚糖酶的分布極其有限，繼而限制了該家族酶的進(jìn)一步挖掘。GH134家族的酶氨基酸序列長(zhǎng)度非常短，一般長(zhǎng)度為180 aa左右，遠(yuǎn)低于其他3 類家族的300～500 aa，這一特點(diǎn)使得只需要30%左右的氨基酸材料就可以合成出所需要的甘露聚糖酶，在本研究中，甘露聚糖酶RmMan134除含有GH134家族的催化結(jié)構(gòu)域外，還含有一個(gè)18 aa組成的信號(hào)肽序列，這使得該蛋白可以分泌到細(xì)胞之外參與糖類的代謝活動(dòng)。經(jīng)多條序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，GH134家族甘露聚糖聚糖酶N端往往含有信號(hào)肽序列特征，與GH5和GH26家族相似，這也說(shuō)明該類家族也很有可能在微生物中廣泛分布。

重組酶RmMan134的最適pH值為6.0，這與GH134家族其他 β - 甘露聚糖酶最適 p H 值十分相似，同樣來(lái)源Rm的甘露聚糖酶RmMan134A的最適pH值為5.0，在pH 7.0～11.0堿性條件下往往表現(xiàn)出非常低的酶活力，甚至?xí)适棵富盍?，而?duì)于甘露聚糖酶RmMan134來(lái)說(shuō)，依然能保持20%～70%以上酶活力，同樣的差異與Streptomyces sp. NRRL B-24484的甘露聚糖酶也比較明顯。

RmMan134更適合在中性pH值環(huán)境發(fā)揮作用，這兩個(gè)同功酶的存在使得Rm對(duì)環(huán)境具有較強(qiáng)適應(yīng)能力。RmMan134與RmMan134A具有相同的最適溫度（50 ℃）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，RmMan134較RmMan134A具有較高的酶反應(yīng)溫度和較好的熱穩(wěn)定性。在反應(yīng)溫度為80 ℃時(shí)，RmMan134表現(xiàn)出20%酶活力，而RmMan134A則喪失酶活力。且酶熱穩(wěn)定性能的差異依然明顯，RmMan134在60 ℃條件下處理30 min依然可以維持50%左右酶活力，而RmMan134A酶活力基本消失。重組酶RmMan134是目前GH134家族反應(yīng)溫度最高的酶，但隨著研究的進(jìn)一步深入，GH134家族來(lái)源的嗜熱甘露聚糖酶應(yīng)該很快會(huì)被挖掘出來(lái)。

甘露聚糖酶可有效的降解甘露聚糖，目前已成為果汁加工中一種新型酶制劑而被加以利用，鑒于GH134家族甘露聚糖酶的最適底物為葡甘露聚糖，因此推測(cè)很可能是水果中甘露聚糖種類造成了重組甘露聚糖酶RmMan134A對(duì)不同果汁澄清效果的差異，其中對(duì)橙汁的澄清效果最為明顯，使橙汁澄清度提高了約76%，優(yōu)于來(lái)自Lactobacillus casei HDS-01甘露聚糖酶的澄清效果，相似的差異在P. acidilactici（M17）來(lái)源的甘露聚糖酶也有所體現(xiàn)。分析發(fā)現(xiàn)L. casei HDS-01菌的甘露聚糖酶屬于GH26家族，而GH26家族和GH134家族采用不同的催化機(jī)制，同時(shí)作用底物也存在差異，這很可能是造成上述差異的主要原因，而更信服的結(jié)論仍需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

7 結(jié)論

本研究成功從濃香大曲中篩選出嗜熱真菌RmHBFH10，并從該菌中挖掘到了1 個(gè)假使蛋白，經(jīng)分析為新型GH134家族甘露聚糖酶（RmMan134）。研究發(fā)現(xiàn)，重組甘露聚糖酶RmMan134在pH 6.0和50 ℃下表現(xiàn)出了最佳活性，并且在從酸性到堿性的廣泛pH值范圍內(nèi)具有較高活性（2.0～11.0），在寬泛pH值范圍內(nèi)和在50℃條件下具有出色的穩(wěn)定性。另外，重組酶RmMan134可以有效地澄清橙汁、桃汁和蘋果汁，其中可使橙汁的澄清度提高約76%。

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