以云南鐵核桃為試材，采用微波輔助法進(jìn)行色素提取試驗(yàn)，采用單因素試驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)對(duì)色素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其穩(wěn)定性及抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為云南鐵核桃色素的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。結(jié)果表明：微波輔助提取云南鐵核桃果皮色素最優(yōu)工藝為微波功率480W，水浴浸提溫度80℃、微波時(shí)間10s、料液比1∶70g·mL-1、乙醇濃度60%、水浴浸提時(shí)間60min。云南鐵核桃果皮色素?zé)岱€(wěn)定性和光穩(wěn)定性差，對(duì)pH較敏感，對(duì)常見(jiàn)食品添加劑較穩(wěn)定，對(duì)Ga2+、Na+、Mg2+、Sn2+穩(wěn)定，對(duì)Fe3+、Cu2+不穩(wěn)定；云南鐵核桃果皮色素對(duì)ABTS+·、DPPH·、OH有較強(qiáng)的清除能力，而且隨著濃度的增加而增大。

鐵核桃(Juglanssigillata)屬胡桃科山核桃屬植物，別名山核桃。核桃具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐貧瘠、耐寒冷、扎根深、生長(zhǎng)快、木材產(chǎn)量較高、果枝的坐果率較高等特點(diǎn)，是一種優(yōu)質(zhì)的農(nóng)林經(jīng)濟(jì)作物，在云南各地區(qū)均有分布，資源豐富。據(jù)研究，鐵核桃葉及花含有烷烴類、蒽醌類、多酚或醇類、黃酮類、多糖、強(qiáng)心苷、三萜類化合物及其揮發(fā)油、鞣質(zhì)等化學(xué)成分，葉片提取物具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抑菌等作用。果實(shí)堅(jiān)硬，可用于制作各種美觀久耐的工藝品，有的還用作把玩核桃。果實(shí)具有厚厚的果皮，每逢核桃收獲的季節(jié)，除少部分被用作燃料外，絕大部分被堆放在田間地頭而腐爛，既浪費(fèi)資源又會(huì)給環(huán)境帶來(lái)負(fù)擔(dān)。隨著核桃產(chǎn)業(yè)的不斷擴(kuò)大，逐步引起研究者的重視，其中，對(duì)其化學(xué)成分及生物功能的研究報(bào)道相對(duì)較多，已從鐵核桃外果皮中提取了60種多種化學(xué)成分，具有應(yīng)用潛力的有效成分20多種，主要為生物堿類、醌類、黃酮類、酚類和酸類等生物活性的成分，有抗菌消炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等作用。還有研究者把鐵核桃外果皮用于制備吸附劑及生物炭，用來(lái)吸附環(huán)境中的污染物，表現(xiàn)出較好的吸附能力。此外，鐵核桃外果皮富含天然色素，在食品及印染行業(yè)有較大應(yīng)用潛能。

近年來(lái)，隨著人們健康意識(shí)逐漸增強(qiáng)，對(duì)天然產(chǎn)品需求不斷增大，從天然產(chǎn)物中提取色素，已經(jīng)成為當(dāng)今世界色素行業(yè)發(fā)展的新趨勢(shì)[12]。羅金岳等研究發(fā)現(xiàn)，天然色素不僅安全性高，大多具有一定營(yíng)養(yǎng)和保健功能，目前，有關(guān)核桃果皮的色素提取、成分分析、性質(zhì)及應(yīng)用研究不斷增加，仲軍梅對(duì)核桃青皮色素進(jìn)行提取，結(jié)果表明色素提取液含有醌、鞣質(zhì)、黃酮及其甙類成分以及K、Na、Mg等營(yíng)養(yǎng)元素。具有耐光性好，耐還原能力比耐氧化能力強(qiáng)，對(duì)毛產(chǎn)品的皂洗、酸洗(pH5)、熱水洗(65℃)、光照穩(wěn)定性均較好等特點(diǎn)。凌慶枝等利用熱水浸提法提取了安徽寧國(guó)山核桃的外果皮色素，并進(jìn)了相關(guān)性質(zhì)試驗(yàn)，研究表明安徽寧國(guó)山核桃的外果皮色素是一種混合物，呈酒紅色，溶解性良好，對(duì)溫度、食鹽、乙醇、蔗糖等影響因子的穩(wěn)定性較好，但對(duì)光的穩(wěn)定性稍差。黃玥等利用超聲輔助萃取的方法提取了核桃青果皮色素，發(fā)現(xiàn)該色素中主要含有單寧和黃酮，含量分別為28.07%和4.86%?；菥У忍骄苛怂蠓ㄌ崛『颂彝夤ぶ械娜玖仙氐淖罴压に?，并確定青皮色素上染棉織物的最佳方法等。簡(jiǎn)未平等[18]將核桃青皮色素用于羊毛織物的染色試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)染色過(guò)程中起主要作用的影響因素是媒染劑Fe2+的用量，然后是染液用量、pH、溫度，但有關(guān)云南鐵核桃果皮色素的相關(guān)研究還較為少見(jiàn)。

因此，該研究以云南保山所產(chǎn)鐵核桃果皮為試材，采用微波輔助法提取色素，考查了微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度、料液比、水浴浸提溫度及水浴浸提時(shí)間對(duì)色素提取的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，并考查察了溫度、pH、食品添加劑、金屬離子對(duì)其穩(wěn)定性的影響及測(cè)定了色素的抗氧化活性，以期為云南鐵核桃果皮色素的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料：云南鐵核桃果皮于2017年10月采自保山市隆陽(yáng)區(qū)，洗凈，鼓風(fēng)干燥箱中55℃烘干，粉碎，得果皮樣品粉，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

供試試劑：氫氧化鈉、濃鹽酸、蔗糖、檸檬酸、水楊酸、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、過(guò)硫酸鉀、抗壞血酸均為分析純，均購(gòu)于阿拉丁試劑網(wǎng)。

供試儀器：722型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠制造)、DFT-250C手提式萬(wàn)能高速粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)、CP214電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)、800型離心沉淀器(上海手術(shù)器械廠)、SHZ-D(III)循環(huán)水真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、G80F20CN2L-R8(R0)微波爐(廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司)、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常德國(guó)華電器有限公司)、N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司制造)、DHG-9030鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1云南鐵核桃果皮色素的提取

準(zhǔn)確稱取1g果皮樣品粉放入具塞錐形瓶中，加入50%乙醇溶液30mL，混勻，置于家用微波爐中，在480W功率下間歇式加熱浸提，每隔10s間歇1次，共加熱20s后，放入70℃水浴鍋中浸提60min，冷卻，離心，收集上層清液至50mL容量瓶中，用50%乙醇溶液定容至刻度，在波長(zhǎng)為510nm[19，20]處測(cè)定吸光度。

1.2.2單因素試驗(yàn)

固定料液比1∶30g·mL-1、乙醇濃度50%、微波加熱時(shí)間20s、水浴浸提溫度70℃、水浴浸提時(shí)間40min，選擇微波功率分別為160、320、480、640、800W，研究微波功率對(duì)色素提取的影響。

固定料液比1∶30g·mL-1、乙醇濃度50%、微波功率480W、水浴浸提溫度70℃、水浴浸提時(shí)間40min，選擇微波時(shí)間分別為10、20、30、40、50s，研究微波時(shí)間對(duì)色素提取的影響。

固定料液比1∶30g·mL-1、微波功率480W、微波時(shí)間20s、水浴浸提溫度70℃、水浴浸提時(shí)間40min，選擇乙醇濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%，研究乙醇濃度對(duì)色素提取的影響。

固定乙醇濃度50%、微波功率480W、微波時(shí)間20s、水浴浸提溫度70℃、水浴浸提時(shí)間40min，選擇料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50g·mL-1，研究料液比對(duì)色素提取的影響。

固定料液比1∶30g·mL-1、乙醇濃度50%、微波功率480W、微波時(shí)間20s、水浴浸提溫度70℃，選擇水浴浸提時(shí)間分別為20、40、60、80、100min，研究水浴浸提時(shí)間對(duì)色素提取率的影響。

固定料液比1∶30g·mL-1、乙醇濃度50%、微波功率480W、微波時(shí)間20s、水浴浸提時(shí)間40min，改變水浴浸提溫度分別為50、60、70、80、90℃，研究水浴浸提溫度對(duì)色素提取率的影響。

選定上述條件按1.2.1方法進(jìn)行色素提取。

1.2.3正交實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用SPSS16.0軟件進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果表明，微波功率、微波時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提時(shí)間5個(gè)因素對(duì)鐵核桃外果皮色素提取率均有顯著影響。考慮試驗(yàn)成本，最終選取浸提時(shí)間(A)、料液比(B)、微波時(shí)間(C)、乙醇濃度(D)4個(gè)因素，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化提取工藝。因素與水平見(jiàn)表1。

1.2.4穩(wěn)定性驗(yàn)證試驗(yàn)

各取等量的色素提取液10mL，分別置于50、60、70、80、90℃水浴中加熱處理20min后，記錄其顏色并測(cè)定吸光度，研究溫度對(duì)云南鐵核桃果皮色素提取液穩(wěn)定性的影響。

各取等量的色素提取液40mL，分別置于暗室、室內(nèi)、太陽(yáng)光照環(huán)境下，每隔1h記錄顏色及測(cè)定其吸光度，研究光照對(duì)云南鐵核桃果皮色素提取液穩(wěn)定性的影響。

各取等量的色素提取液10mL，使用一定濃度的鹽酸、氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)提取液的pH分別至1、3、5、7、9、11、13，搖勻靜置5min后，分別測(cè)定其吸光度，研究pH對(duì)云南鐵核桃果皮色素提取液穩(wěn)定性的影響。

各取等量的色素提取液20mL，分別加入5mL一定濃度的蔗糖、食鹽、檸檬酸、葡萄糖溶液，搖勻，靜置10min后，分別測(cè)定其吸光度，研究食品添加劑對(duì)云南鐵核桃果皮色素提取液穩(wěn)定性的影響。

各取等量的色素提取液10mL，分別加入2mL不同濃度的含Ga2+、Na+、Mg2+、Sn2+、Fe3+、Cu2+離子溶液，搖勻，靜置10min后，分別測(cè)其吸光度，研究金屬離子對(duì)云南鐵核桃果外皮色素提取液穩(wěn)定性的影響。

1.3項(xiàng)目測(cè)定

1.3.1ABTS清除能力測(cè)定
ABTS清除能力參照范金波等方法進(jìn)行測(cè)定。將10mL7.4mmol·L-1ABTS與10mL2.6mmol·L-1過(guò)硫酸鉀混合均勻，室溫避光放置12～16h，形成ABTS+儲(chǔ)備液，然后用無(wú)水乙醇稀釋，在波長(zhǎng)為734nm處測(cè)定其吸光度，使吸光度值為0.702(無(wú)水乙醇調(diào)零)得工作液，密封保存?zhèn)溆?。?支10mL比色管中分別加入0.6mL不同濃度的色素提取液，再各加入7.4mLABTS+·工作液，振蕩搖勻后置于30℃恒溫水浴中反應(yīng)6min，測(cè)定734nm波長(zhǎng)下的吸光度Ax。同時(shí)以同體積的乙醇代替色素溶液為空白對(duì)照，測(cè)定吸光度A0，以同體積乙醇代替ABTS+·溶液作為樣品對(duì)照，測(cè)定吸光度Ax0。以維生素C為對(duì)照。ABTS+·清除率(%)=A0-(Ax-Ax0)/A0×100。

1.3.2DPPH清除能力測(cè)定

DPPH·清除能力參照王之珺等方法進(jìn)行測(cè)定。于5支10mL比色管中分別加入5.0mL不同濃度的色素樣品液，再各加入5.0mL0.5mmol·L-1DPPH乙醇溶液，混合均勻后避光反應(yīng)30min，在517nm處測(cè)定吸光Ax。以同體積的超純水代替色素提取液為空白對(duì)照，測(cè)定吸光度A0，以同體積乙醇代替乙醇DPPH溶液為樣品對(duì)照，測(cè)定吸光度Ax0。以維生素C為對(duì)照。DPPH·清除率(%)=A0-(Ax-Ax0)/A0×100。

1.3.3OH清除能力測(cè)定

OH清除能力參照鄭宇翔等的方法進(jìn)行測(cè)定。向5支10mL比色管中分別加入1mL不同濃度的色素提取液，再加入0.3mL9.0mmol·L-1FeSO4、最后加入0.25mL20mmol·L-1H2O2，震蕩搖勻，靜置10min后，各加入1mL9.0mmol·L-1水楊酸乙醇溶液搖勻，于37℃恒溫水浴中反應(yīng)30min，取出后冷卻至室溫。在510nm處測(cè)吸光度Ax。用等體積的超純水代替樣品液作空白對(duì)照并測(cè)定吸光度A0。以等體積超純水代替水楊酸作為樣品對(duì)照并測(cè)定吸光值A(chǔ)x0。以維生素C為對(duì)照。·OH清除率(%)=A0-(Ax-Ax0)/A0×100。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用SPSS16.0及Excel2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

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