壇紫菜是我國(guó)南方沿海地區(qū)大規(guī)模人工養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)海藻。壇紫菜可多次采收，第一次采收的壇紫菜俗稱(chēng)頭水壇紫菜，第二次至第四次采收的壇紫菜分別稱(chēng)為二水、三水及四水壇紫菜，四水以后的壇紫菜通常稱(chēng)為末水壇紫菜。末水壇紫菜由于色澤差、口感粗、售價(jià)低、獲利少，因而養(yǎng)殖者常放棄采收，導(dǎo)致其腐爛在海中，既浪費(fèi)了資源，又污染了環(huán)境。然而，末水壇紫菜中依然含有較高的蛋白質(zhì)、多糖、膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)成分，因此，高值化利用末水壇紫菜，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和生態(tài)意義。

由于末水壇紫菜中多糖含量很高，因此目前對(duì)該資源的深加工主要集中在多糖方面。陳美珍等測(cè)定出末水壇紫菜多糖含量為20.67％，他們用熱水提取的多糖為分子量28.54kDa的單一組分，主要由半乳糖(83.12％)、3，6-內(nèi)醚半乳糖(15.71％)和硫酸基(10.61％)組成。王賢等分別用熱水法和微波法對(duì)福建平潭地區(qū)的末水壇紫菜提取多糖，提取率分別為4.037％和5.054％。謝飛等認(rèn)為由于末水壇紫菜蛋白質(zhì)多于多糖，因此采用常規(guī)方法難以去除蛋白，且多糖損失大。他們通過(guò)比較幾種除蛋白的方法，認(rèn)為用木瓜蛋白酶去除蛋白效果最佳，因此多糖提取率最高。

多糖提取方法很多，其中超聲波輔助水提法由于多糖提取率高而受到重視。這是因?yàn)槌暡ǖ目栈饔每善扑榧?xì)胞，從而使多糖易溶出，且該法提取溫度低、提取時(shí)間短，因而可避免多糖提出后的降解。基于此，本研究先采用超聲波輔助水提末水壇紫菜多糖，再用木瓜蛋白酶去除粗多糖中的蛋白質(zhì)，以期提高末水壇紫菜多糖提取率，并為末水壇紫菜多糖的深入研究和末水壇紫菜的深加工提供數(shù)據(jù)參考和技術(shù)支持。

一、材料與方法

1、原料與試劑

末水壇紫菜，取自湛江雷州東里鎮(zhèn)；木瓜蛋白酶(酶活力80.0萬(wàn)IU／g)，北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司；葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2、主要儀器設(shè)備

S-450D超聲波細(xì)胞破碎儀(400W，20kHz)，必能信超聲(上海)有限公司；興盛XS-10B500克多功能粉碎機(jī)，東莞隆鑫機(jī)電設(shè)備有限公司；HH-6恒溫水浴鍋，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠(chǎng)；UV-1240紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司；TDZ5-WS離心機(jī)，湖南省湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司；202-3電熱恒溫干燥箱，鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司；FE20K臺(tái)式pH計(jì)，廣州市怡華新電子儀器有限公司；透析袋MD34(3500Da)，北京中生瑞泰科技有限公司。

3、實(shí)驗(yàn)方法

（1）末水壇紫菜預(yù)處理

將末水壇紫菜清洗、去雜后剪碎，用無(wú)水乙醇浸泡24h脫脂，以利于多糖提取。浸泡結(jié)束后水洗末水壇紫菜，并于60℃烘干，最后粉碎過(guò)40目篩，收集備用。

（2）末水壇紫菜多糖的提取

稱(chēng)取4.0g末水壇紫菜粉末于燒杯中，加水?dāng)嚢杈鶆?，然后置于超聲波?xì)胞破碎儀中進(jìn)行超聲波輔助水提多糖。提取結(jié)束后于3000r／min離心10min，收集上清液置于另一燒杯中，然后對(duì)上清液旋蒸濃縮至原體積的1／3。在濃縮液中加入適量木瓜蛋白酶充分水解蛋白質(zhì)，然后將pH調(diào)到木瓜蛋白酶等電點(diǎn)8.75，使木瓜蛋白酶沉淀析出，5000r／min離心10min后，取上清液置入透析袋，蒸餾水透析24h以除去氨基酸及鹽離子，透析期間第4、8、16h時(shí)分別換水一次。最后，將透析袋內(nèi)的多糖溶液凍干，獲得粉末狀精多糖。

（3）末水壇紫菜多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：Y=1.22571x-0.32267，R²=0.99447(y表示吸光度，x表示葡萄糖質(zhì)量濃度)。將獲得的粉末狀精多糖用適量水溶解后測(cè)其吸光度，然后代入回歸方程可求得多糖質(zhì)量濃度。按下式計(jì)算多糖提取率：多糖提取率／％=[c×V／(m×1000)]×100，式中，c為多糖濃度(mg／mL)；V為多糖溶液體積(mL)；m為末水壇紫菜粉末質(zhì)量(g)。

（4）超聲波輔助水提多糖工藝優(yōu)化

超聲波輔助水提末水壇紫菜多糖，然后用2％(mg／mL)的木瓜蛋白酶在45℃下水解60min去除蛋白后獲得精多糖。設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)分別考察提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、水料比(C)三個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響。在此基礎(chǔ)上，以多糖提取率為響應(yīng)指標(biāo)，對(duì)上述三因素設(shè)計(jì)L₉(3⁴)正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助水提多糖工藝參數(shù)。

（5）木瓜蛋白酶去除蛋白工藝優(yōu)化

采用最優(yōu)超聲波輔助水提工藝提取出末水壇紫菜多糖，然后用木瓜蛋白酶去除蛋白。設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)分別考察加酶量(D)、水解溫度(E)、水解時(shí)間(F)三個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響。在此基礎(chǔ)上，以多糖提取率為響應(yīng)指標(biāo)，對(duì)上述三因素設(shè)計(jì)L₉(3⁴)正交試驗(yàn)優(yōu)化木瓜蛋白酶去除蛋白工藝參數(shù)。

二、結(jié)果與分析

1、超聲波輔助水提多糖工藝優(yōu)化結(jié)果

（1）單因素試驗(yàn)結(jié)果

提取溫度、提取時(shí)間、水料比三個(gè)因素對(duì)末水壇紫菜多糖提取率的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知：(1)在提取溫度40～70℃范圍內(nèi)，末水壇紫菜多糖提取率隨溫度升高而增大，但在60～70℃范圍內(nèi)，多糖提取率增加緩慢；此后隨溫度繼續(xù)升高，多糖提取率逐漸減小。這可能是因?yàn)闇囟壬呖杉铀俣嗵菑慕M織細(xì)胞內(nèi)溶出，溫度升到一定程度時(shí)，多糖會(huì)出現(xiàn)降解，當(dāng)多糖降解速度高于溶出速度時(shí)，多糖提取率便開(kāi)始下降。(2)在超聲波細(xì)胞破碎儀作用下，組織細(xì)胞被破碎導(dǎo)致多糖迅速溶出，可大大減少提取時(shí)間。提取時(shí)間為3min時(shí)，多糖提取率已達(dá)到6.9％，此后隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，多糖提取率增加緩慢，而在5min后，多糖提取率開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是因?yàn)樵黾犹崛r(shí)間雖然可以使更多的多糖從細(xì)胞內(nèi)溶出，但隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖受熱水長(zhǎng)時(shí)間浸泡可能會(huì)出現(xiàn)降解。(3)水料比在20:1～30:1(mL／g)時(shí)，多糖提取率隨水料比的增大而快速增加，此后繼續(xù)加大水量，多糖提取率增加緩慢。原因可能是水量增加有利于多糖溶出，但當(dāng)水量增加到一定程度時(shí)，多糖溶解會(huì)趨于飽和而導(dǎo)致很難繼續(xù)從細(xì)胞內(nèi)溶出。另外，加水量不宜太多，否則會(huì)增加后續(xù)濃縮過(guò)程的能耗和時(shí)間。

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