鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛的新鮮或干燥莖，其為藥食兩用植物。長期以來，許多東方國家將石斛用于草藥制劑中，而在中國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過60種石斛。鐵皮石斛具有很好的抑制衰老、抑制腫瘤、抗氧化、提高機體免疫能力的功效，并且可用于腫瘤、糖尿病、慢性咽炎胃炎、機體免疫下降等的輔助治療。生物堿類、多糖類、菲類等物質(zhì)為鐵皮石斛的主要化學成分，其中多糖是其主要有效成分且較之生物堿和菲類，多糖含量較高。

近年來，人們對多糖的功效認知逐漸增多，鐵皮石斛多糖的研究也越來越多。尚喜雨用水提法、酶法對鐵皮石斛多糖的提取進行了研究，分別得到最佳提取條件后，以最佳提取條件進行提取并比較提取得率，結(jié)果水提法的多糖平均提取率為12.07％，酶法的多糖平均提取率為20.84％。何鐵光等從鐵皮石斛原球莖中提取得到多糖DcPPla-1，并研究了DCPPla-1對羥基自由基和超氧陰離子的清除作用，發(fā)現(xiàn)多糖DCPPla-1對二者的清除作用均比較明顯，同時多糖DcPPla-l對由Fe²⁺和H₂0₂誘導的小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化具有極顯著的抑制作用(P＜0.01)。查學強等研究了鐵皮石斛多糖對超氧陰離子自由基、羥基自由基的清除作用及對烷基自由基引發(fā)的亞油酸氧化體系的抑制作用，結(jié)果表明，多糖對超氧陰離子自由基、羥基自由基具有不同程度的清除作用，對烷基自由基引發(fā)的亞油酸氧化體系有顯著的抑制作用。

本文采用正交試驗方法，確定鐵皮石斛多糖的最佳提取工藝條件。并通過測定鐵皮石斛多糖對1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、超氧陰離子(02-)、羥基自由基(-OH)的清除能力以及鐵皮石斛多糖對三價鐵的還原能力來研究其抗氧化活性。

一、材料與方法

1、實驗材料與試劑

鐵皮石斛干燥莖由江蘇益斛生物科技有限公司提供；無水乙醇、正丁醇、氯仿、石油醚等均為分析純，DPPH、水楊酸、抗壞血酸、雙氧水、鐵氰化鉀等均為分析純化學試劑，均由天津江天化工有限公司提供。

2、實驗儀器與設(shè)備

主要儀器設(shè)備有HW-SY型電熱恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表公司)；TGL-16B型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；LGJ-0.5型冷凍干燥機(軍事醫(yī)學科學院實驗儀器廠)；Model680型酶標儀(ThermoElectronU.S.A)。

3、實驗方法

（1）鐵皮石斛多糖的提取

將干燥的石斛莖粉碎，過篩。稱取10g粉末，用石油醚在80℃下回流提取3h進行脫脂，然后過濾。濾渣繼續(xù)用無水乙醇回流提取3h進行脫色，過濾并干燥，加入適量體積倍數(shù)的蒸餾水在恒溫水浴鍋中提取多糖，得到多糖提取液，進行多次提取，提取液合并濃縮；采用Sevag試劑脫蛋白5次，然后旋蒸除去Sevag試劑；水層用去離子水透析24h，再加入4倍體積的無水乙醇沉淀；離心后，沉淀物依次用乙酸乙酯和丙酮洗滌，沉淀溶解在水中并凍干，得到鐵皮石斛多糖。多糖得率計算公式：

多糖得率(％)=(鐵皮石斛多糖質(zhì)量／鐵皮石斛粉末質(zhì)量)×100

(2)單因素試驗和正交試驗

以鐵皮石斛多糖的提取得率為評價指標，考察熱水浸提中提取時間、料液比、提取溫度、提取次數(shù)四個因素對鐵皮石斛多糖提取的影響。根據(jù)單因素試驗的結(jié)果確定各個因素的水平范圍并以此進行正交試驗。

(3)鐵皮石斛多糖對DPPH清除能力的測定

根據(jù)Sllimada等的方法測定鐵皮石斛多糖的DPPH清除能力，并進行了一些修改。將多糖樣品配制成濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0m咖L的多糖溶液，然后準確吸取2.0mL多糖溶液加入到由鋁箔覆蓋的試管中，再分別加入0.2mmol／L的DPPH-乙醇溶液2.0mL，劇烈振蕩、混勻，避光反應(yīng)30min。在517nm處測定其吸光度值，每個樣品濃度測定三組平行。同時用維生素C溶液作陽性對照。
DPPH自由基清除活性(RSA)計算公式如下：
 

式中：A₁為DPPH-乙醇溶液和蒸餾水的吸光度值；

A₂為樣品溶液和無水乙醇溶液的吸光度值；

A₃為DPPH-乙醇溶液和樣品溶液的吸光度值。

（4）鐵皮石斛多糖對超氧陰離子清除能力的測定

根據(jù)查學強和王麗霞等的方法測定鐵皮石斛多糖對超氧陰離子的清除能力，并進行了部分修改。將多糖樣品配制成濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg／mL的多糖溶液，將pH為8.2的50mmol／L的Tris-HCl緩沖液在25℃下預(yù)熱20min，然后吸取Tris-HCl緩沖液2.0mL和0.5mL多糖溶液混勻，立即加入1.0mL7mmo兒的鄰苯三酚溶液，迅速搖勻，在25℃下反應(yīng)5min，在325nm處測定其吸光度值，每個樣品濃度測定三組平行。同時用維生素C溶液作陽性對照。

超氧陰離子清除活性(RSA)計算公式如下：

（5）鐵皮石斛多糖對羥基自由基清除能力的測定

根據(jù)smironoff和wang等提出的方法測定鐵皮石斛多糖對羥基自由基的清除能力，并加以改進。將多糖樣品配制成濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg／mL的多糖溶液，然后吸取2.0mL多糖溶液與2.0mL9mmol／L的Fes0₄和2.0mL9mmol／L的水楊酸-乙醇溶液，混合，靜置10min，加入2.0mL8.8mm01幾的H₂0₂，在37℃下反應(yīng)30min，在510nm處測定其吸光度值，每個樣品濃度測定三組平行。同時用維生素C溶液作陽性對照。

羥基自由基清除活性(RSA)計算公式如下：

式中：A₁為不加樣品的溶液的吸光度值；

A₂為不加水楊酸-乙醇的溶液的吸光度值；

A₃為樣品溶液的吸光度值。

（6）鐵皮石斛多糖還原能力的測定

根據(jù)文獻所述方法測定鐵皮石斛多糖的還原能力，并進行一些修改。將多糖樣品配制成濃度梯度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg／mL的多糖溶液，將1.0mL多糖溶液、2.5mLpH為6.6的0.2mol／L磷酸鹽緩沖液、2.5mL1％鐵氰化鉀溶液混合，在50℃水浴中反應(yīng)20min后加入2.5mL10％的三氯乙酸，搖勻后離心(400r／min)。吸取2.5mL上清液，然后加入2.5mL蒸餾水、6.5mL0.1％氯化鐵溶液，靜置反應(yīng)10min，在700nm處測定其吸光度值，每個樣品濃度測定三組平行。同時用維生素C溶液作陽性對照。以吸光度值表示其還原能力。

二、結(jié)果與分析

1、正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗確定的各因素水平范圍得到正交因素水平表，如表1所示。根據(jù)因素水平表進行L₉(3⁴)正交試驗，試驗結(jié)果如表2所示。正交試驗方差分析結(jié)果如表3所示。

根據(jù)表2中的R值可知R_A＞R_B＞R_C＞R_D，則四個因素對多糖提取得率影響由大到小為提取時間＞料液比＞提取溫度＞提取次數(shù)。根據(jù)K值確定各因素最佳水平，考慮到試驗所需的時間、原料等因素，確定提取次數(shù)為3次。最終得到鐵皮石斛多糖提取的最佳提取條件為A₂B₃C₂D₂，即提取時間2h，料液比1:80，提取溫度80℃，提取次數(shù)3次。由表3方差分析結(jié)果可知通過在0.05顯著水平上的檢驗，提取時間和料液比兩種因素對鐵皮石斛多糖提取得率有顯著影響。

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