1.2 比色適配體傳感器

比色適配體傳感器利用具有高消光系數(shù)的顯色基團(tuán)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的有效檢測(cè)，其最大的優(yōu)勢(shì)是能夠通過(guò)肉眼觀察，且易于操作、成本較低。

金納米粒子(gold nanoparticles，Au NPs)常被用于比色適配體傳感器的構(gòu)建，其消光系數(shù)遠(yuǎn)高于有機(jī)染料，為比色測(cè)定提供了高靈敏度的保障。帶負(fù)電的Au NPs可以將適配體吸附在其表面，使適配體在高鹽條件下保護(hù)Au NPs，被廣泛地應(yīng)用于比色適配體傳感器的建立。KIM等建立了一種基于鹽誘導(dǎo)負(fù)電荷Au NPs聚集的比色適配體傳感器檢測(cè)土霉素。適配體對(duì)Au NPs具有保護(hù)作用，所以加入土霉素后其會(huì)與適配體結(jié)合，導(dǎo)致保護(hù)作用減少，Au NPs從紅色變?yōu)樽仙?，其顏色變化很容易用肉眼觀察或通過(guò)紫外/可見(jiàn)光譜儀測(cè)量，最終得到了25 nmol/L的LOD。RAMEZANI等開(kāi)發(fā)了基于三螺旋分子開(kāi)關(guān)(triple-helix molecular switch，THMS)檢測(cè)四環(huán)素的比色傳感器，具有較高的穩(wěn)定性、靈敏度和選擇性。WU等設(shè)計(jì)了一種基于Au NPs可控聚集的無(wú)標(biāo)記比色適配體傳感器，用于抗生素多重檢測(cè)。選擇氯霉素和四環(huán)素作為目標(biāo)物，設(shè)計(jì)多功能適配體，當(dāng)添加一種抗生素時(shí)，特異性識(shí)別的適配體片段會(huì)結(jié)合并解離，而非特異性的則在高鹽條件下協(xié)調(diào)控制Au NPs的聚集。檢測(cè)四環(huán)素時(shí)，該方法具有0.05～3.0μmol/L的線性范圍，LOD低至32.9 nmol/L。該傳感器可通過(guò)肉眼直接分辨多種抗生素，可以利用智能手機(jī)分析。除帶負(fù)電的Au NPs，帶正電的Au NPs也可以用于比色傳感器的建立。LUO等以巰基乙胺修飾的金納米粒子(cysteamine-stabilized gold nanoparticles，CS-Au NPs)為探針建立了一種比色適配體傳感器用于牛奶中四環(huán)素殘留的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)原理如圖3所示，當(dāng)沒(méi)有四環(huán)素時(shí)，帶正電的金納米粒子與帶負(fù)電的適配體因靜電引力而沉聚;當(dāng)有四環(huán)素存在時(shí)，其與適配體結(jié)合，且兩者之間的相互作用強(qiáng)于適配體和CS-Au NPs之間的靜電相互作用，導(dǎo)致CS-Au NPs分散，顏色仍保持為紅色。該方法檢出限為0.039μg/m L，線性范圍為0.2～2.0μg/m L，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，特異性強(qiáng)。但是，在復(fù)雜的基質(zhì)中，金納米粒子容易受到鹽粒子的影響，出現(xiàn)非特異性聚集變色現(xiàn)象，制約了其實(shí)際應(yīng)用。

基于酶或模擬酶的催化顯色反應(yīng)常被應(yīng)用于比色適配體傳感器的建立，此類傳感器不僅具備肉眼可見(jiàn)的檢測(cè)結(jié)果，而且可通過(guò)酶促催化的信號(hào)放大效應(yīng)獲得更高的靈敏度。KIM等使用生物素標(biāo)記的適配體間接競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)適配體測(cè)定牛奶中的土霉素，LOD為27 nmol/L，具有高特異性和穩(wěn)定性，且不涉及復(fù)雜的樣品提取步驟。ZHANG等基于金納米簇(gold nanoclusters，Au NCs)固有的類過(guò)氧化物酶活性建立了比色適配體傳感器，利用適配體提高Au NCs在H2O2的作用下催化氧化底物3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB)的活性。檢測(cè)四環(huán)素的濃度范圍為1～16μmol/L，LOD低至46 nmol/L，該方法的肉眼檢測(cè)能力估計(jì)為0.5μmol/L。該比色傳感平臺(tái)具有良好的準(zhǔn)確性、特異性和可重復(fù)性，但酶或模擬酶對(duì)檢測(cè)條件要求較高，因此也存在一定的局限性。

1.3 電化學(xué)適配體傳感器

電化學(xué)傳感器是將生物分子和靶分子的相互作用轉(zhuǎn)變成電流或電位的形式表現(xiàn)出來(lái)的一類傳感器[50]。常用的電化學(xué)分析技術(shù)有差分脈沖伏安法(differential pulse voltammetry，DPV)、電化學(xué)阻抗法(electrochemical impedance spectroscopy，EIS)、方波伏安法(square wave voltammetry，SWV)、循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry，CV)等。將核酸適配體與電化學(xué)相結(jié)合，在加入靶標(biāo)之后，適配體的構(gòu)型發(fā)生改變，進(jìn)而引起電極表面修飾物的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響電化學(xué)信號(hào)輸出，從而建立靈敏、快捷、簡(jiǎn)單的生物傳感器。按照是否應(yīng)用標(biāo)記物，電化學(xué)適配體傳感器可分為標(biāo)記型和非標(biāo)記型2類。

應(yīng)用于標(biāo)記型適配體傳感器的標(biāo)記物質(zhì)主要有2種，一種具有電活性，如亞甲基藍(lán)、二茂鐵等;一種具有催化活性，如葡萄糖脫氫酶、辣根過(guò)氧化物酶、金屬納米材料、碳納米管等。標(biāo)記物質(zhì)可通過(guò)化學(xué)修飾、物理吸附等方法標(biāo)記在適配體上，當(dāng)適配體與目標(biāo)物結(jié)合后，標(biāo)記物質(zhì)因適配體構(gòu)型改變而發(fā)生位置變化，從而引起電化學(xué)信號(hào)的變化。XU等[52]設(shè)計(jì)靈敏高效的比率型電化學(xué)傳感器用于牛奶中四環(huán)素的檢測(cè)。該方法整合了2個(gè)適配體傳感器，其一基于二茂鐵和Au NPs納米復(fù)合材料，其二基于碳納米纖維和Au NPs納米復(fù)合材料的適配體傳感器。通過(guò)Au NPs與適配體5'端的硫醇之間形成Au-S鍵，將適配體有效地固定在絲網(wǎng)印刷的碳電極表面，最后通過(guò)比率計(jì)算其檢測(cè)結(jié)果，解決了批次之間差異大的問(wèn)題，LOD為3.3×10?7 g/L。LIU等[53]設(shè)計(jì)了一種新型的夾心型電化學(xué)適配體傳感器，該傳感器基于三維結(jié)構(gòu)的石墨烯納米金復(fù)合物和適配體-Au NPs-辣根過(guò)氧化物酶納米探針實(shí)現(xiàn)土霉素的檢測(cè)，納米金和辣根過(guò)氧化物酶修飾的適配體提高了親和力并實(shí)現(xiàn)了超靈敏檢測(cè)。

非標(biāo)記型電化學(xué)適配體傳感器與標(biāo)記型相比，操作更簡(jiǎn)單、對(duì)目標(biāo)物影響小，在實(shí)際應(yīng)用方面優(yōu)勢(shì)更加突出。CHEN等開(kāi)發(fā)了一種檢測(cè)四環(huán)素的無(wú)標(biāo)記電化學(xué)適配體傳感器。根據(jù)電化學(xué)阻抗譜分析，當(dāng)四環(huán)素濃度在5.0～5.0×103之間時(shí)，四環(huán)素的對(duì)數(shù)濃度與電荷轉(zhuǎn)移電阻在之間存在線性關(guān)系。該傳感器的LOD為1 ng/m L，檢測(cè)時(shí)間為15 min。在4℃下保存15 d后，電流變化在8.5%以內(nèi)，證明該傳感器具有良好的重現(xiàn)性和可接受的穩(wěn)定性。WANG等結(jié)合三螺旋適配體探針、催化發(fā)夾自組裝(catalyzed hairpin assembly，CHA)信號(hào)放大和主客識(shí)別等技術(shù)，設(shè)計(jì)出一種用于四環(huán)素定量檢測(cè)的電化學(xué)新型傳感策略。當(dāng)目標(biāo)物與適配體結(jié)合后，發(fā)生構(gòu)象變化的三螺旋適配體探針引發(fā)CHA擴(kuò)增反應(yīng)，加入的核酸外切酶III會(huì)破壞2個(gè)DNA發(fā)夾形成的大量雙螺旋結(jié)構(gòu)，釋放大量電活性分子，這些分子由于主客識(shí)別而在β-環(huán)糊精的幫助下擴(kuò)散到電極表面，從而產(chǎn)生信號(hào)。在最佳條件下，該策略線性范圍為0.2～100 nmol/L，LOD低至0.13 nmol/L。但是電化學(xué)適配體傳感器尤其是非標(biāo)記型的抗干擾能力還有待加強(qiáng)，對(duì)適配體與目標(biāo)物的結(jié)合效率要求較高。

1.4 表面等離子體共振適配體傳感器

表面等離子體共振(surfaceplasmon resonance，SPR)技術(shù)利用全反射時(shí)入射光可以和金屬表面的等離子體發(fā)生共振的原理，探測(cè)生物分子之間是否發(fā)生作用，將SPR芯片表面上固定適配體，可以實(shí)現(xiàn)SPR適配體傳感平臺(tái)的建立，具有無(wú)需標(biāo)記、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。近幾年，WANG等[36]結(jié)合DNA納米結(jié)構(gòu)和商用Biacore T200 SPR儀器開(kāi)發(fā)出一種簡(jiǎn)單的SPR適配體傳感器用于四環(huán)素的檢測(cè)。該傳感器為了減少空間位阻，提高固定化適配體對(duì)四環(huán)素的捕獲效率，引入DNA四面體以納米級(jí)距離定向固定適配體，從而將適配體的特異性、DNA納米結(jié)構(gòu)的易于制造、SPR儀器的靈敏性和自動(dòng)化的優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來(lái)，實(shí)現(xiàn)快速、靈敏檢測(cè)蜂蜜中的四環(huán)素。SPR傳感器需要與納米技術(shù)的聯(lián)用以滿足對(duì)小分子物質(zhì)檢測(cè)的靈敏度要求，另外，SPR芯片需要被進(jìn)一步優(yōu)化，以降低實(shí)驗(yàn)成本。

1.5 表面增強(qiáng)拉曼光譜適配體傳感器

表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)技術(shù)是一種基于光的非彈性散射的光譜技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于食品安全和生物分析領(lǐng)域[56]。與常規(guī)的拉曼光譜相比，SERS光譜強(qiáng)度能高出4～6個(gè)數(shù)量級(jí)左右。近幾年，MENG等基于DNA序列連接金納米粒子間的拉曼熱點(diǎn)構(gòu)建了一種表面增強(qiáng)拉曼光譜適配體檢測(cè)水產(chǎn)品中土霉素。該方法將拉曼信號(hào)分子修飾在Au NPs的表面，當(dāng)有目標(biāo)物OTC存在時(shí)，適配體序列優(yōu)先與OTC結(jié)合，導(dǎo)致13 nm的Au NPs更接近80 nm的Au NPs，拉曼強(qiáng)度因生成的熱點(diǎn)增強(qiáng)而增加。在最佳條件下，該方法具有4.60×10-2～4.60×102 fg/m L的線性范圍，LOD低至4.35×10-3 fg/m L。LI等[38]研究出一種基于磁性納米球靶向功能的SPR適配體傳感器檢測(cè)四環(huán)素。該傳感器將適配體修飾在共軛磁鐵礦膠體納米晶體簇-聚甲基丙烯酸磁性納米球上，將適配體互補(bǔ)序列(c DNA)修飾在Au/PATP/Si O2(APS)上，適配體與目標(biāo)物的結(jié)合導(dǎo)致c DNA-APS游離于上清液中，產(chǎn)生較強(qiáng)的拉曼信號(hào)。在最佳條件下，該方法具有0.001～100 ng/m L的線性范圍，LOD低至0.001 ng/m L。盡管這2個(gè)適配體傳感器可以提供靈敏的檢測(cè)，但整體成本很高，限制了其實(shí)際應(yīng)用。

2 結(jié)束語(yǔ)

由于四環(huán)素類抗生素的廣泛使用直接或間接危害到人們的身體健康，因此建立簡(jiǎn)單、靈敏且快速的四環(huán)素類抗生素檢測(cè)方法尤為重要。核酸適配體具有高靈敏度、高選擇性、易于合成、批次差異小等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于構(gòu)建光學(xué)、電化學(xué)等各類生物傳感器檢測(cè)四環(huán)素類抗生素，但是核酸適配體的應(yīng)用方面也面臨著一些問(wèn)題。復(fù)雜的基質(zhì)可能會(huì)影響適配體與目標(biāo)物的結(jié)合效率，故而樣品前處理是核酸適配體傳感器發(fā)展需要注意的重要問(wèn)題。為提高方法的靈敏度，引入催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)等核酸擴(kuò)增技術(shù)以實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，對(duì)適配體應(yīng)用的發(fā)展具有重要意義。同時(shí)，將適配體應(yīng)用于試劑盒、試紙條、智能手機(jī)等便攜式快速檢測(cè)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)是適配體未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。提高適配體的篩選水平，建立高通量、多目標(biāo)物檢測(cè)方法，仍是科研工作者未來(lái)需努力的方向。

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