基于激光的電離質(zhì)譜具有空間分辨率高、樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單、易于便攜化和可實(shí)現(xiàn)成像分析等特點(diǎn)?；|(zhì)輔助的激光離子源質(zhì)譜可以避免高能量對(duì)分子結(jié)構(gòu)的破壞，在生物大分子分析和檢測(cè)方面獲得了廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)輔助基質(zhì)在低分子量范圍的干擾較強(qiáng)，極大地限制了常壓基質(zhì)輔助激光離子源的應(yīng)用，為解決這一問題，一系列基于新型材料的輔助基質(zhì)被設(shè)計(jì)和開發(fā)出來。這些新型材料可分為兩大類：新型有機(jī)基質(zhì)和無機(jī)材料。質(zhì)量范圍的擴(kuò)展和目標(biāo)化合物靈敏度的增強(qiáng)，顯著擴(kuò)展了常壓基質(zhì)輔助激光離子化技術(shù)在原位分析中的應(yīng)用。該文針對(duì)新型輔助基質(zhì)在常壓激光離子源及其在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，并展望了未來的研究趨勢(shì)。

近年來，基于激光的敞開式離子源憑借其高效、原位、高空間分辨率和易于成像等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、食品安全等領(lǐng)域，如常壓基質(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù)(Atmospheric pressure matrix assisted laser desorption/ionization，AP-MALDI)、電噴霧輔助激光解吸電離技術(shù)(Electrospray-assisted laser desorption/ionization，ELDI)、基質(zhì)輔助激光解吸電噴霧電離技術(shù)(Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization，MALDESI)、激光燒蝕電噴霧電離技術(shù)(Laser-ablation electrospray ionization，LAESI)、激光輔助解吸電噴霧電離技術(shù)(Laser-assisted desorption electrospray ionization，LADESI)、激光解吸電噴霧電離源(Laser-desorption electrospray ionization，LDESI)、激光燒蝕大氣壓光電離技術(shù)(Laser-ablation atmospheric-pressure photoionization，LAAPPI)、激光解吸常壓化學(xué)電離源(Laser-desorption atmospheric-pressure chemical ionization，LD-APCI)等?；诩す獾碾婋x技術(shù)雖然極大地促進(jìn)了質(zhì)譜分析向?qū)崟r(shí)、原位檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，但解離過程中存在分子結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重、激光能量轉(zhuǎn)化效率低等問題，常需要添加輔助基質(zhì)以提高對(duì)激光能量的吸收，改善特定波長(zhǎng)激光的能量轉(zhuǎn)化效率。

AP-MALDI是一種在大氣壓條件下工作的軟電離技術(shù)，也是最常用的敞開式激光電離源，對(duì)于較難離子化的大分子物質(zhì)(102～106 Da)，特別是蛋白質(zhì)類的生物大分子，具有一定的離子化效果。AP-MALDI技術(shù)具有分析速度快、靈敏度高、實(shí)時(shí)原位檢測(cè)等特點(diǎn)，與另一種軟電離方法電噴霧離子源(ESI)相比，AP-MALDI對(duì)樣品的前處理要求更寬松，且更易得到單電荷離子峰?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，AP-MALDI在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、食品等行業(yè)得到了廣泛應(yīng)用。最近的研究表明，AP-MALDI可與便攜質(zhì)譜(Portable mass spectrometry)相結(jié)合，極大地提高現(xiàn)場(chǎng)分析能力。

AP-MALDI的工作原理是使用激光照射待測(cè)物質(zhì)與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜時(shí)，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給待測(cè)分子，而電離過程中涉及到待測(cè)物質(zhì)電荷轉(zhuǎn)移和由固態(tài)至氣態(tài)的相轉(zhuǎn)變過程，最后待測(cè)物以氣態(tài)離子的形式進(jìn)入質(zhì)量分析器(見圖1)。此外，基質(zhì)的加入還可起到分散分析物的作用，防止分析物之間發(fā)生相互作用或產(chǎn)生類似于二聚體的信號(hào)。在此過程中，基質(zhì)及其添加劑的性質(zhì)(如酸堿度、分子量，是否具有發(fā)色團(tuán))、基質(zhì)的使用方法等會(huì)直接影響共結(jié)晶的厚度和均勻程度，進(jìn)而對(duì)電離的整體效果和分析結(jié)果的準(zhǔn)確性、靈敏性和重復(fù)性造成巨大影響[8]。因此，選擇合適的基質(zhì)或基質(zhì)添加劑對(duì)于AP-MADLI的電離效果至關(guān)重要。

 圖1 基質(zhì)輔助激光解吸電離的離子源原理及新型基質(zhì)研發(fā)策略
 

Fig.1 Mechanism of matrix assisted laser desorption/ionization and development strategy of new matrix

1 AP-MALDI輔助基質(zhì)的研究進(jìn)展

根據(jù)基質(zhì)的作用和既往研究，總結(jié)出輔助基質(zhì)的幾個(gè)基本特點(diǎn)。首先，基質(zhì)和待測(cè)樣品應(yīng)具有較好的互溶性，或可溶于同一類溶劑中，使得基質(zhì)材料存在于溶劑蒸發(fā)后與分析物形成的共結(jié)晶中，此時(shí)可認(rèn)為基質(zhì)材料是待測(cè)物的固體溶劑。其次，基質(zhì)必須具有較強(qiáng)的特征波長(zhǎng)吸收性質(zhì)。AP-MALDI中的待測(cè)物需要由基質(zhì)進(jìn)行激光能量的吸收和轉(zhuǎn)移來實(shí)現(xiàn)軟電離，以避免樣品分子在激光中不必要的斷裂。除此之外，合格的基質(zhì)還應(yīng)具有反應(yīng)惰性，既不與待測(cè)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)改變其結(jié)構(gòu)和含量，又需有一定的吸附和解吸附能力。值得注意的是，揮發(fā)性的基質(zhì)一般需提前進(jìn)行排除，以減少基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。除了考慮以上特性外，基質(zhì)的選擇還需要結(jié)合待測(cè)物的分子質(zhì)量范圍和理化性質(zhì)進(jìn)行評(píng)估。然而，現(xiàn)有基質(zhì)常具有局限性，例如基質(zhì)與樣品分子共結(jié)晶不均勻，基質(zhì)與樣品間能量轉(zhuǎn)移效果差，基質(zhì)自身的電離峰干擾樣品檢測(cè)，這些問題阻礙著AP-MALDI的進(jìn)一步應(yīng)用。開發(fā)穩(wěn)定不易電離，能夠與樣品形成均勻而分散良好的共結(jié)晶的基質(zhì)是推動(dòng)AP-MALDI進(jìn)展的首要任務(wù)。

1.1 傳統(tǒng)基質(zhì)概述

自激光離子源(LDI)問世以來，最重要的突破莫過于使用基質(zhì)作為化學(xué)反應(yīng)的媒介。傳統(tǒng)的基質(zhì)幾乎均為有機(jī)基質(zhì)，具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，在245～355 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有明顯的紫外吸收，且分子量主要集中于200 Da左右，例如α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、4-羥基-3，5-二甲氧基肉桂酸(SA)、9-氨基吖啶(9-AA)、2，4，6-三羥基苯乙酮(THAP)和2，5-二羥基苯甲酸(DHB)等。在這類基質(zhì)中，可離子化的羧基、羥基是檢測(cè)多肽、蛋白質(zhì)等極性物質(zhì)的基質(zhì)中常見的官能團(tuán)，均能表現(xiàn)出一定的質(zhì)子親和力，可與分析物之間形成質(zhì)子交換。然而，傳統(tǒng)基質(zhì)在檢測(cè)樣品時(shí)易出現(xiàn)部分區(qū)域內(nèi)的信號(hào)強(qiáng)度明顯增大(稱之為“熱點(diǎn)”)，而其他區(qū)域信號(hào)強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。“熱點(diǎn)”出現(xiàn)的不均勻性、隨機(jī)性和難避免性導(dǎo)致每次檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度會(huì)出現(xiàn)明顯差異，這對(duì)樣品的檢測(cè)重現(xiàn)性有著不利影響。此外，基質(zhì)自身電離產(chǎn)生的碎片離子峰會(huì)掩蓋、抑制或增強(qiáng)樣品的峰信號(hào)，干擾后續(xù)的質(zhì)譜分析。為此，對(duì)現(xiàn)有基質(zhì)進(jìn)行加工修飾或開發(fā)新基質(zhì)等改善措施是刻不容緩的。

1.2 有機(jī)基質(zhì)的研究進(jìn)展

目前有機(jī)基質(zhì)的使用最為廣泛，且適合多種目標(biāo)物的分析，其中，尼克酸是最早應(yīng)用于MALDI中的有機(jī)基質(zhì)。隨著人們對(duì)有機(jī)基質(zhì)不斷深入的研究和發(fā)展，更多的有機(jī)基質(zhì)因其在MALDI中良好的適用性而被發(fā)掘，如CHCA、9-AA、DHB等。雖然這些有機(jī)小分子在基質(zhì)輔助激光離子源中具有一定的通用性和穩(wěn)定性，但隨著檢測(cè)目標(biāo)的擴(kuò)大和檢測(cè)要求的增加，傳統(tǒng)基質(zhì)的局限性限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。最初，由于小分子物質(zhì)的化學(xué)可塑性，人們著力于傳統(tǒng)基質(zhì)的優(yōu)化，這在一定程度上提高了對(duì)某些特定對(duì)象的分析表現(xiàn)，但其局限性未得到有效改善。而對(duì)傳統(tǒng)基質(zhì)進(jìn)行修飾，或采用添加劑、混合基質(zhì)等方法，是目前比較主流的改善基質(zhì)輔助激光離子化效率的方法。

1.2.1 針對(duì)傳統(tǒng)基質(zhì)的修飾

Fukuyama團(tuán)隊(duì)通過對(duì)傳統(tǒng)DHB基質(zhì)進(jìn)行長(zhǎng)鏈烷基化修飾，得到新基質(zhì)烷基化二羥基苯甲酸(ADHB)。由于疏水烷基鏈的引入，基質(zhì)和疏水性多肽的結(jié)合能力大大增強(qiáng)，從而改善了該疏水性物質(zhì)的檢測(cè)效果。將ADHB與傳統(tǒng)基質(zhì)CHCA進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)ADHB對(duì)疏水性肽鏈的結(jié)合效果顯著增強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度提高了10～100倍，但“熱點(diǎn)”不均勻現(xiàn)象并未得到很好地改善，且ADHB因單獨(dú)作為基質(zhì)缺乏離子化能力而只能被用作添加劑。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了進(jìn)一步探索：引入烷烴鏈對(duì)傳統(tǒng)基質(zhì)THAP進(jìn)行功能化修飾，產(chǎn)生新基質(zhì)烷基化三羥基苯乙酮(ATHAP)。與傳統(tǒng)基質(zhì)CHCA相比，該新基質(zhì)規(guī)避了“熱點(diǎn)”的產(chǎn)生，檢出限降低了1個(gè)數(shù)量級(jí)。除了功能化修飾外，新原子的引入對(duì)于基質(zhì)的質(zhì)子親和力也具有很大影響。Jaskolla團(tuán)隊(duì)以CHCA的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)引入了氯，產(chǎn)生的新基質(zhì)Cl-CHCA相對(duì)于傳統(tǒng)CHCA表現(xiàn)出更強(qiáng)的多肽親和力以及檢測(cè)靈敏度，同時(shí)重現(xiàn)性也得到改善。膜蛋白對(duì)于生物系統(tǒng)至關(guān)重要，但其特殊的性質(zhì)使分析和檢測(cè)成為難題，尤其是疏水性膜蛋白。Wang等對(duì)CHCA的羧基烷基鏈進(jìn)行酯化修飾，并合成了一系列衍生物，其中CHCA-C3對(duì)完整蛋白分子表現(xiàn)出極高的檢測(cè)靈敏度。這主要?dú)w功于該新基質(zhì)的高激光消融能力以及分子間疏水親和力的提升。總體來說，針對(duì)某種特定目的進(jìn)行傳統(tǒng)基質(zhì)的修飾是一種簡(jiǎn)單、可行、有效的方法。

1.2.2 基于傳統(tǒng)基質(zhì)的混合基質(zhì)

以傳統(tǒng)基質(zhì)的理化性質(zhì)為基礎(chǔ)，結(jié)合不同添加劑或不同性質(zhì)的基質(zhì)進(jìn)行總體基質(zhì)的改變，是近年來研究人員探索的一種較簡(jiǎn)易的方法。Abdelhamid等將糠酸和甲芬那酸混合生成新基質(zhì)，用于檢測(cè)谷胱甘肽、三磷酸腺苷、磺胺噻唑等混合物。新基質(zhì)可有效吸收激光能量并進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移，減少了離子碎片峰的數(shù)量，并顯著提高離子化效率。將新基質(zhì)與傳統(tǒng)基質(zhì)DHB進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，新基質(zhì)在真空條件下呈現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性，推測(cè)是由于混合基質(zhì)中的甲芬那酸具有高于DHB基質(zhì)1.2倍的升華能力。Lu等以喹諾酮類物質(zhì)為基質(zhì)添加劑，檢測(cè)血液中的痕量喹那普利。研究發(fā)現(xiàn)含氮化合物可以抑制血液中共存物對(duì)喹那普利分析的干擾，而傳統(tǒng)基質(zhì)CHCA即使經(jīng)過優(yōu)化、修飾也不能很好解決這一難題。同時(shí)比較了氧氟沙星、雙氟沙星等喹諾酮類物質(zhì)作為基質(zhì)添加劑的效果，證實(shí)使用該類物質(zhì)作為基質(zhì)添加劑對(duì)血液中痕量喹那普利的識(shí)別和定量具有很好的效果。

1.2.3 離子液體基質(zhì)

由于傳統(tǒng)基質(zhì)中“熱點(diǎn)”不均勻問題的不可避免，在AP-MALDI檢測(cè)過程中信號(hào)處理往往需通過平均化全部光斑區(qū)域的光譜能量以獲得更可靠的結(jié)果，但經(jīng)過平均化的結(jié)果準(zhǔn)確性和重復(fù)性較差，參考意義低，不能用于量化。因此，相關(guān)解決方法必須從基質(zhì)與分析物共結(jié)晶的均勻性入手，例如通過快速蒸發(fā)基質(zhì)溶液或添加改性劑，但這些改進(jìn)往往需要復(fù)雜操作或額外設(shè)備，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)分析效果的改善。近年來，液體基質(zhì)的應(yīng)用極大改善了輔助基質(zhì)中共結(jié)晶不均勻問題，尤其是離子液體，受到越來越多研究者的青睞。離子液體是指在室溫下呈液態(tài)，熔點(diǎn)低于100 ℃的鹽，于2001年首次出現(xiàn)在輔助基質(zhì)的報(bào)道中，但當(dāng)時(shí)所用的室溫離子液體因不具有顯著的紫外吸收性質(zhì)而未得到重視。隨著科技進(jìn)步，研究人員在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，通過等摩爾混合經(jīng)典的酸性輔助基質(zhì)(CHCA、DHB、SA)與不同的有機(jī)堿(吡啶、三丁胺、1-甲基咪唑)產(chǎn)生新的液體基質(zhì)。這些新基質(zhì)顯示出很好的兼容性與分析性能，很大程度上改善了固體基質(zhì)的“熱點(diǎn)”問題。Shrivas團(tuán)隊(duì)將CHCA-丁胺與DHB-丁胺進(jìn)行等摩爾混合得到新的離子液體基質(zhì)，用于鑒別小鼠肝細(xì)胞和腦切片中的磷脂及其分布。采用質(zhì)譜成像技術(shù)對(duì)新基質(zhì)和普通基質(zhì)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果證明離子液體基質(zhì)可有效改善共結(jié)晶不均勻問題，并且高重復(fù)性證實(shí)了此方法的有效性和可靠性。由于寡糖與傳統(tǒng)基質(zhì)中碎片離子的分子量較為接近，使用AP-MALDI區(qū)分和檢測(cè)寡糖較為困難。Pei等分別考察了4種生物堿與DHB合成的離子液體基質(zhì)，選擇2，5-二羥基苯甲酸丁胺(DHB-BuN)作為基質(zhì)用于分析寡糖樣品，并證實(shí)該方法具有較好的靈敏度和重復(fù)性。在此基礎(chǔ)上，對(duì)大豆和大豆葉直接切片后進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI-MS)成像分析，省去了繁瑣的前處理過程，且使用該基質(zhì)質(zhì)譜檢測(cè)背景干擾低，寡糖的分布清晰，重復(fù)性好。Ling等開發(fā)了一種由四甲基胍和THAP以3 ∶1混合而成的離子液體基質(zhì)，優(yōu)化后的基質(zhì)表現(xiàn)出很好的重現(xiàn)性和耐鹽性，可在負(fù)離子模式下有效降低磷酸化肽的碎裂，選擇性地提升磷酸化肽的檢出率。這進(jìn)一步說明離子液體基質(zhì)在基質(zhì)輔助激光離子源中具有很大的應(yīng)用潛力。

1.2.4 新型有機(jī)基質(zhì)

盡管采用不同的添加劑或修飾方法可在很大程度上對(duì)現(xiàn)有基質(zhì)進(jìn)行改造，但開發(fā)新的有機(jī)化合物作為基質(zhì)仍是該領(lǐng)域的熱門方向，尤其是針對(duì)一些缺少質(zhì)子化基團(tuán)、穩(wěn)定性差、極性大的目標(biāo)物，因?yàn)檫@類目標(biāo)物的質(zhì)譜分析往往需要冗長(zhǎng)繁瑣的前處理程序。鹽類物質(zhì)在近年也被用作新基質(zhì)。Chen等發(fā)現(xiàn)含氮物質(zhì)在負(fù)離子模式下的檢測(cè)性能更好，選擇N-(1-萘基)-乙二胺作為新輔助基質(zhì)在負(fù)離子模式下分析小分子化合物，結(jié)果表明與傳統(tǒng)基質(zhì)CHCA和DHB相比，新基質(zhì)的碎片離子峰更少，靈敏度更高。Wang等使用香豆素類化合物作為基質(zhì)用于疏水性化合物的分析，并比較了5種常見香豆素以及傳統(tǒng)基質(zhì)CHCA和DHB在MALDI中的分析性能，其中6，7-二羥基香豆素-3-羧酸對(duì)于疏水性化合物表現(xiàn)出更好的檢測(cè)靈敏度、穩(wěn)定性以及重現(xiàn)性。由于糖苷鍵的不穩(wěn)定性，相應(yīng)的分析檢測(cè)方法往往使用堿金屬添加劑來保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。此外，一些生物特異性的識(shí)別分子也被用于基質(zhì)修飾，以提高方法選擇性，如核酸適配體修飾、分子印跡修飾等。

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