酶活力對(duì)AFs降解率的影響:將酶活力分別為1、2、3、4U和5U的漆酶分別與10μL0.1mg/mL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液渦旋振蕩混勻，30℃、200r/min孵育12h。對(duì)照組為加入同等體積的pH5.7的0.1mol/L的PBS₁其他條件相同。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，降解率按式（1）計(jì)算:

（8）AFs的提取

將孵育時(shí)間對(duì)AFs降解率的影響:將酶活力為3U的漆酶與10μL0.1mg/mL的AFB₁標(biāo)準(zhǔn)溶液渦旋振蕩混勻，置于30℃、200r/min分別孵育12、24、36、48h和60h。對(duì)照組為加入同等體積的pH5.7的0.1mol/L的磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebuffersaline，PBS），其他條件相同。孵育溫度對(duì)AFs降解率的影響:將酶活力為3U的漆酶與10μL0.1mg/mL的AFB₁標(biāo)準(zhǔn)溶液渦旋振蕩混勻，分別置于25、30、35、40℃和45℃溫度下，200r/min孵育12h。對(duì)照組為加入同等體積的pH5.7的0.1mol/L的PBS，其他條件相同。酶活力對(duì)AFs降解率的影響:將酶活力分別為1、2、3、4U和5U的漆酶分別與10μL0.1mg/mL的AFB₁標(biāo)準(zhǔn)溶液渦旋振蕩混勻，30℃、200r/min孵育12h。對(duì)照組為加入同等體積的pH5.7的0.1mol/L的PBS₁其他條件相同。處理的樣品12000r/min離心30s，使管壁上的發(fā)酵液離心至管底部，并轉(zhuǎn)移至10mL的具塞玻璃管中，向玻璃管中加入等體積的三氯甲烷（在通風(fēng)處進(jìn)行），渦旋振蕩10min使其充分混勻，然后倒入離心管中，靜置30min分層，取上層液體于玻璃管中，加入等體積三氯甲烷，吸取下層有機(jī)相清液于離心管中，相同操作重復(fù)3次。合并3次有機(jī)相于氮吹管中，于45℃氮?dú)獯蹈伞Ｔ儆眉状既芤喝芙獬鯝Fs，并用0.22μm濾膜過濾。

（9）HPLC-MS/MS檢測(cè)AFs及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制的毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和提取的毒素溶液均用0.22μm濾膜過濾至液相小瓶中。

HPLC條件:液相模塊為安捷倫1260Infinity:Inertsil0DS-3C18色譜柱（150mmX4.6mm，3μm）；流速0.2mL/min；進(jìn)樣量5μL；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為甲醇-水（3:7，V/V）；分析時(shí)間30min；檢測(cè)溫度30℃。

MS/MS條件:電噴霧離子源:監(jiān)測(cè)模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；離子源溫度300℃:錐孔電壓15psi；碰撞電壓135V；碰撞能量30eV:毛細(xì)管電壓4kV；質(zhì)量掃描范圍m/z313.0～285.0。

（10）響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以孵育時(shí)間、孵育溫度和酶活力作為考察因素，以AFB₁降解率為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平如表1所示。

（11）AFB₁降解產(chǎn)物的測(cè)定及結(jié)構(gòu)解析

HPLC條件:ZORBAX-SBC18色譜柱（100mmX2.1mm，3.5μm）。流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-甲醇溶液。梯度洗脫程序:40%B，6min；60%B，維持16min；100%B，8min；總共運(yùn)行30min。進(jìn)樣量5μL，流速0.4mL/min，柱溫箱30℃。

MS條件:霧化氣GS1壓力50psi；霧化氣GS2壓力50psi；氣簾氣壓力35psi；離子源溫度550℃:離子源，電壓5500V；一級(jí)掃描去簇電壓100V；聚焦電壓10V；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1500；二級(jí)掃描采用TOFMS-Productlon-IDA模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，誘導(dǎo)碰撞解離能量分別為20、40V和60V，進(jìn)樣前，用蠕動(dòng)泵做質(zhì)量軸校正，使質(zhì)量軸誤差小于0.002%。

二、結(jié)果與分析

1、漆酶的同源模建結(jié)果

在本實(shí)驗(yàn)所用漆酶晶體結(jié)構(gòu)未被解析的情況下，利用某些已知漆酶晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上同源模建可以，最大程度上獲得理想的目的蛋白三維結(jié)構(gòu)。利用ChemBioDraw2014軟件以及MOEv2014.0901軟件繪制并轉(zhuǎn)換成三維結(jié)構(gòu)，如圖1所示。研究AFs與該酶的結(jié)合模式首先需要構(gòu)建同源模型，結(jié)果如表2和圖2所示。圖3分析顯示，99%的漆酶殘基位于蛋白構(gòu)像的合理區(qū)域，這表明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的漆酶同源模型符合立體化學(xué)規(guī)則，具有合理性。

2、漆酶與AFB₁的相互作用分析

采用分子對(duì)接手段研究AFB₁與栓菌漆酶表面的相互作用，旨在分析AFB₁與漆酶相互作用模式。為明確漆酶和毒素的結(jié)合模式，采用誘導(dǎo)契合的策略，根據(jù)配體的構(gòu)象側(cè)鏈?zhǔn)荏w口袋允許移動(dòng)適應(yīng)，將毒素分別對(duì)接到漆酶的活性部位，得到漆酶活力位點(diǎn)與配體的結(jié)合模式，如圖4所示，對(duì)接打分為-6.4532kca/mol。
 

根據(jù)所構(gòu)建的對(duì)接模型，如圖4所示，AFB₁上甲氧基的氧原子可作為氫鍵的受體，與漆酶上一個(gè)高度保守同時(shí)也靠近銅離子（T1CuI）位置的His481上氨基酸側(cè)鏈形成氫鍵，另外，AFB₁呋喃環(huán)上的氧原子也可以作為氫鍵的受體，與漆酶Asn288的側(cè)鏈形成氫鍵，因此，His481和Asn288是漆酶和AFB₁結(jié)合時(shí)的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，通過氫鍵相互作用。

酶-配體的結(jié)合親和力與其相互作用的效率有關(guān)，受到配體的結(jié)構(gòu)特征和扭曲程度以及配體和酶表面之間形狀互補(bǔ)的影響。有研究表明氫鍵是酶與配體相互作用的關(guān)鍵作用力，參與氫鍵形成的氨基酸殘基被認(rèn)為是漆酶與小分子配體相互作用的關(guān)鍵殘基。其中氧原子與氨基酸殘基形成的氫鍵作用強(qiáng)于碳原子與氨基酸殘基形成的氫鍵，且氫鍵鍵長(zhǎng)越短，作用越強(qiáng)。對(duì)接模擬研究表明，存在于T1銅配位層中的保守的殘基His481最可能與AFs發(fā)生相互作用，形成氫鍵，推測(cè)其可以介導(dǎo)氧化過程中的電子轉(zhuǎn)移，提高電子傳遞效率，從而提高漆酶催化能力。綜合多方面原因造成酶對(duì)毒素的作用能力存在差異，表現(xiàn)為對(duì)接分?jǐn)?shù)不同。

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