黃曲霉毒素是二氫呋喃香豆素的衍生物，是一類主要由黃曲霉、寄生曲霉和集峰曲霉等產(chǎn)生的高毒性的次級代謝產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的致癌、致畸和致突變性。目前發(fā)現(xiàn)20多種AFs，其中AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂為天然毒素，其他毒素主要由這4種衍生得到，已經(jīng)鑒定得到10多種常見的AFs結(jié)構(gòu)。其中，AFB是自然界發(fā)生的最常見的、毒性最強(qiáng)的化學(xué)致癌物，被國際腫瘤研究機(jī)構(gòu)劃定為Ⅰ級致癌物質(zhì)，并且未規(guī)定安全劑量。目前，對AFs的脫除方法有物理脫除（物理吸附、擠壓膨化、輻射處理、微波、等離子體降解等）、化學(xué)脫除（臭氧、氨氣熏蒸、生物堿、乳酸等）及生物脫除（生物吸附、生物降解等）等方法，前2種方法存在效果不穩(wěn)定、營養(yǎng)成分損失較大以及難以規(guī)?；a(chǎn)等缺點(diǎn)，而生物脫除法由于過程溫和、無營養(yǎng)物質(zhì)大量流失及本身和降解生成物不會對人畜造成危害等優(yōu)點(diǎn)受到學(xué)者的廣泛關(guān)注并展開了諸多研究。

漆酶（ECI.10.3.2）是一種含銅的氧化還原酶，屬藍(lán)多銅氧化酶家族，廣泛分布于自然界的昆蟲、高等植物、真菌（擔(dān)子菌、子囊菌和半知菌中較多）和細(xì)菌中。漆酶具有廣泛的作用底物，能催化酚類、芳胺類、羧酸類、甾體類及其他一些雜環(huán)類化合物發(fā)生氧化生成水而不產(chǎn)生有害的過氧化氫和活性氧等中間產(chǎn)物?；诖司G色催化特性，漆酶在工業(yè)廢水處理、紡織染料漂白、紙漿木質(zhì)素去除、土壤和水的生物修復(fù)等環(huán)境生態(tài)領(lǐng)域有非常廣泛的應(yīng)用，在生物燃料電池、生物傳感器、制藥等方面的經(jīng)濟(jì)價(jià)值也得到飛速擴(kuò)展和提升。關(guān)于漆酶對AFB₁降解的研究卻甚少，且主要集中在降解率的測算上，可達(dá)到55%～87.34/%，然而對生成的代謝物結(jié)構(gòu)的認(rèn)識并不明確。

隨著漆酶分子生物學(xué)研究的不斷深入，近年來一些真菌漆酶的晶體結(jié)構(gòu)相繼被解析，為進(jìn)一步揭示真菌漆酶的催化機(jī)制提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。然而晶體的獲得較為復(fù)雜，在某些已知漆酶晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上同源模建可以最大程度上獲得理想的目的蛋白三維結(jié)構(gòu)，而分子對接技術(shù)可以將獲得的三維結(jié)構(gòu)分子逐一放在靶標(biāo)分子的活性位點(diǎn)處，通過模擬小分子配體與生物大分子受體相互作用，預(yù)測其結(jié)合模式和親和力。分子對接是探索真菌漆酶酶促降解AFB₁規(guī)律和機(jī)制的重要手段，對于預(yù)測漆酶降解AFB₁效果有重要的意義，而通過實(shí)驗(yàn)制備理論預(yù)測效果好的改性漆酶將進(jìn)一步明晰其催化和降解機(jī)制。本研究通過分子對接模擬漆酶與AFB，的結(jié)合模式并用實(shí)際降解實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，利用超高效液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步豐富AFs解毒機(jī)理等相關(guān)理論，為漆酶降解AFB₁的可行性提供一定的參考。

一、材料與方法

1、材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用產(chǎn)重組漆酶LAC3的釀酒酵母菌株由Dr、ThierryTron's實(shí)驗(yàn)室贈送。

三氯甲烷（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純），美國MerdaTechnologyInc公司；AFB，百靈威科技有限公司。

2、儀器與設(shè)備

CR22N高速冷凍離心機(jī)，日本Himac有限公司；ZWY-200D智誠恒溫振蕩器，上海智誠分析儀器制造有限公司；HPLC-TripleQ-LC-MS，美國Agilent公司；UPLC-Triple-TOF-MS，美國Waters公司。

3、方法

（1）栓菌漆酶的同源模建

漆酶的目的基因序列通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步核實(shí)，對應(yīng)的ID為Q6TH77。通過BLAST選擇了蛋白數(shù)據(jù)庫PDB中ID為3KW7的漆酶作為模板（氨基酸序列相似性均大于65%），采用MOEv2014.0901軟件進(jìn)行同源模建。在pH7和溫度300K條件下利用LigX優(yōu)化蛋白質(zhì)的質(zhì)子化狀態(tài)和氫原子的取向。首先，將目標(biāo)序列與模板序列比對，并構(gòu)建10個(gè)獨(dú)立的中間模型。這些不同的同源模型是不同環(huán)候選物和側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的排列選擇的結(jié)果。根據(jù)GB/VI的打分函數(shù)得分最高的被選為最終的模型，使用AMBER12/EHT高壓力場進(jìn)一步能量最小化。

（2）AFs三維結(jié)構(gòu)繪制

用ChemBioDraw2014軟件繪制AFB1二維結(jié)構(gòu)圖，并通過軟件MOEv2014.0901中的EnergyMinimize模塊進(jìn)行能量優(yōu)化，轉(zhuǎn)換成三維結(jié)構(gòu)。

（3）漆酶與AFB1分子對接

應(yīng)用軟件MOEv2014.0901中的Dock模塊，預(yù)測AFs和同源模建蛋白漆酶的結(jié)合能力。在正式對接之前，選擇AMBER12:EHT力場以及R-field隱式溶劑模型。對接流程采用柔性的inducedfit模式，受體結(jié)合口袋氨基酸的側(cè)鏈可根據(jù)配體構(gòu)象進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，約束側(cè)鏈轉(zhuǎn)動的權(quán)重設(shè)置為10。AFs的結(jié)合模式首先通過LondondG打分函數(shù)進(jìn)行排序，前30個(gè)構(gòu)象通過進(jìn)一步力場優(yōu)化和GBVI/WSAdG方法進(jìn)行再次評價(jià)。采用最佳結(jié)合構(gòu)象模型將配體對接到漆酶的活性位點(diǎn)，根據(jù)對接分?jǐn)?shù)、氫鍵作用和關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析對接結(jié)果。

（4）AFs標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別準(zhǔn)確稱量1mg的AFB₁標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于1mL色譜級甲醇中，配制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，并進(jìn)行梯度稀釋，配制成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液用于降解實(shí)驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，-20℃避光保存，待用。

（5）菌株活化及發(fā)酵液制備

菌株活化培養(yǎng)基（S-Gal平板）:酵母氮源（YNB，無氨基酸）6.7g/L，酪蛋白氨基酸5g/L，琥珀酸緩沖液50mmo/L（pH5.3），半乳糖6.7g/L，色氨酸40mg/L，腺嘌呤鹽酸鹽80mg/L，硫酸銅100μmol/L，愈創(chuàng)木酚0.02%，瓊脂15g/L。

漆酶發(fā)酵培養(yǎng)基（S-Gal）:酵母氮源（YNB，無氨基酸）6.7g/L，酪蛋白氨基酸5g/L，琥珀酸緩沖液50mmol/L（pH5.3），半乳糖6.7g/L，色氨酸40mg/L，腺嘌呤鹽酸鹽80mg/L，硫酸銅100μumol/L。

將菌株轉(zhuǎn)接到S-Gal平板上，28℃恒溫培養(yǎng)2～3d，進(jìn)行活化。將產(chǎn)漆酶的釀酒酵母菌株接種到裝有S-Gal培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于30℃、160r/min搖床培養(yǎng)4d，進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)。在8000r/min條件下離心30min沉淀菌體，上清液即為漆酶粗酶液，并根據(jù)LiuYingli等的方法進(jìn)行漆酶純化。

（6）漆酶活力檢測

根據(jù)呂春鶴等提供的方法并進(jìn)行改進(jìn)測定漆酶活力。在30℃、420nm波長下連續(xù)監(jiān)測2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）的氧化速率，在石英比色皿中分別加入pH4.0的0.04mol/LBritton-Robison緩沖液和0.5mmol/L的ABTS溶液，漆酶1min氧化1μmol底物定義為1個(gè)活力單位。

（7）漆酶與AFs作用的降解條件

孵育時(shí)間對AFs降解率的影響:將酶活力為3U的漆酶與10μL0.1mg/mL的AFB₁標(biāo)準(zhǔn)溶液渦旋振蕩混勻，置于30℃、200r/min分別孵育12、24、36、48h和60h。對照組為加入同等體積的pH5.7的0.1mol/L的磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebuffersaline，PBS），其他條件相同。

孵育溫度對AFs降解率的影響:將酶活力為3U的漆酶與10μL0.1mg/mL的AFB₁標(biāo)準(zhǔn)溶液渦旋振蕩混勻，分別置于25、30、35、40℃和45℃溫度下，200r/min孵育12h。對照組為加入同等體積的pH5.7的0.1mol/L的PBS，其他條件相同。

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