目的對(duì)都梁丸的入血成分進(jìn)行分析研究，探討都梁丸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。方法采用偏頭痛模型小鼠，灌胃給藥制得含藥血清和空白血清，通過(guò)比較都梁丸、酒燉白芷和川芎體外供試品及含藥血清樣品和空白血清樣品的HPLC色譜圖，根據(jù)保留時(shí)間及對(duì)照品，明確都梁丸給藥后血中移行成分。結(jié)果都梁丸給藥后，在血清中共有22個(gè)移行成分，其中18個(gè)成分為原形入血成分，4個(gè)成分為原型成分的代謝產(chǎn)物，經(jīng)對(duì)照品確認(rèn)了12種原型成分。結(jié)論這22個(gè)血中移行成分可能是都梁丸在體內(nèi)直接作用的藥效物質(zhì)，為深入研究其作用機(jī)制、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及劑型改革提供了科學(xué)依據(jù)。

都梁丸收載于中國(guó)藥典2015年版一部，由白芷(酒燉)和川芎2味藥組成，具有祛風(fēng)散寒，活血通絡(luò)之功效，臨床用于風(fēng)寒淤血阻滯脈絡(luò)所致的頭痛，為治療偏頭痛的常用中成藥，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制尚未完全闡明。由于中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，所以中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵。中藥血清藥物化學(xué)是以傳統(tǒng)藥物化學(xué)為基礎(chǔ)，分析鑒定口服中藥后血清中移行成分，確定中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的應(yīng)用學(xué)科。本研究以中藥血清藥物化學(xué)為研究思路，通過(guò)偏頭痛模型小鼠給藥，分析含藥血清、空白血清、混合對(duì)照品及體外供試品的高效液相色譜圖，確定都梁丸入血成分及其來(lái)源，從而為深入研究都梁丸的效應(yīng)物質(zhì)、質(zhì)量標(biāo)志物及劑型改革研究提供科學(xué)依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent)；SG3300H超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)；XW-80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器有限公司)；MTN-2800氮吹濃縮儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；HC-2062高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。

1.2試藥

硝酸甘油注射液(北京益民藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20161118；規(guī)格：1 mL∶1 mg)；黃酒(鎮(zhèn)江恒順酒業(yè)有限公司，批號(hào)：20171102)；白芷、川芎均購(gòu)自安國(guó)市光明飲片加工廠，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定為傘形科植物白芷AngeLicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.的干燥根、川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根；酒燉白芷實(shí)驗(yàn)室自制[7](批號(hào)：20180407)；都梁丸按中國(guó)藥典2015年版一部標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下制法自制(批號(hào)：20180412，質(zhì)量：每丸9 g±5%)；花椒毒酚(批號(hào)：K21M5C1；純度≥98%)、水合氧化前胡素(批號(hào)：R25A6F2764；純度≥98%)、白當(dāng)歸素(批號(hào)：P01028SA13；純度≥98%)、佛手柑內(nèi)酯(批號(hào)：RF0224FA14；純度≥98%)、白當(dāng)歸腦(批號(hào)：P0103SA13；純度≥98%)、氧化前胡素(批號(hào)：Y26A6S2757；純度≥98%)和異歐前胡素(批號(hào)：ZM0531BB13；純度≥98%)對(duì)照品均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；歐前胡素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110826-200307；純度≥98%)；阿魏酸(批號(hào)：17092501；純度≥98%)、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ(批號(hào)：17121104；純度≥98%)、洋川芎內(nèi)酯A(批號(hào)：17051901；純度≥98%)、藁本內(nèi)酯(批號(hào)：18010201；純度≥98%)均購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純；水為娃哈哈純凈水。

1.3動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠，♀♂各半，體質(zhì)量(20±2)g，8周齡，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001；動(dòng)物批號(hào)：20180510。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：300 nm。流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%磷酸溶液；梯度程序：0~50 min，5%→65%A，50~70 min，65%→95%A；流速：1 mL·min^-1。供試品溶液進(jìn)樣量為20μL，混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣量為10μL。

2.2體外供試品溶液的制備

分別取酒燉白芷、川芎(過(guò)80目篩)各約0.2 g，取都梁丸，剪碎，混勻，取約3 g，精密稱(chēng)定，精密加入等量的硅藻土，研勻，取約2 g，精密稱(chēng)定，分別置25 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min(功率180 W，頻率50 kHz)，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)至原質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，分別取續(xù)濾液作為體外供試品溶液。

2.3給藥樣品的制備

將都梁丸、酒燉白芷細(xì)粉、川芎細(xì)粉加入到0.4%CMC-Na溶液中，超聲配制成混懸液，即得相當(dāng)于含生藥濃度為0.312 5 g·mL^-1的都梁丸給藥溶液、0.25 g·mL^-1的酒燉白芷給藥溶液、0.1 g·mL^-1的川芎給藥溶液。

2.4混合對(duì)照品溶液的制備

取花椒毒酚、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、白當(dāng)歸腦、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，分別加70%甲醇至刻度，搖勻，得到各對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于2 mL離心管中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為8.75，3.4，6，6.25，8.25，3.25，8，6.25，5.8，20.9，84.4，34.6μg·mL^-1的混合對(duì)照品溶液。

2.5空白血清與含藥血清的制備

取SPF級(jí)昆明小鼠20只，每組5只，分為4組，即空白組、都梁丸組、酒燉白芷組、川芎組，分別禁食12 h，都梁丸組以0.04 mL·g^-1灌胃都梁丸粉末混懸液，酒燉白芷組以0.04 mL·g^-1灌胃酒燉白芷粉末混懸液，川芎組以0.025 mL·g^-1灌胃川芎粉末混懸液，連續(xù)給藥3 d，每天1次，空白組按0.04 mL·g^-1體質(zhì)量灌胃0.4%CMC-Na溶液。于末次給藥1 h后，空白組皮下注射無(wú)水乙醇(2.0 mL·kg^-1)，其余各組均皮下注射硝酸甘油注射液(0.01 mL·g-1)，復(fù)制小鼠偏頭痛模型，造模后出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、爬籠次數(shù)增多、前肢頻繁搔頭、煩躁不安等行為癥狀，表明模型制作成功。各組分別于灌胃后3 h摘眼球取血，每只0.5 mL，5只合并搖勻，以消除個(gè)體差異，室溫放置1 h，離心5 min(10 000 r·min^-1)，分離血清，即為含藥血清，-80℃冷藏備用。同法制備空白血清。

2.6血清樣品處理

分別取各組含藥血清、空白血清0.25 mL，置離心管中，加入甲醇0.75 mL，渦旋3 min，混勻，離心5 min(13 000 r·min^-1)，取上清液，于36℃下氮?dú)饬鞔蹈桑瑲堅(jiān)?0%甲醇100μL渦旋3 min，超聲5 min，離心5 min(13 000 r·min^-1)，取上清液過(guò)0.22μm微孔濾膜，即為各組含藥血清、空白血清供試品溶液。

2.7方法學(xué)考察

2.7.1儀器精密度試驗(yàn)

取同一份都梁丸含藥血清供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各共有峰保留時(shí)間和面積，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD，結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間均<0.8%，相對(duì)峰面積均<2.5%，表明儀器精密度良好。

2.7.2穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份都梁丸含藥血清供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣分析，記錄各共有峰保留時(shí)間和面積，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD，結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間均<0.9%，相對(duì)峰面積均<2.8%，表明含藥血清供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.3重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次的都梁丸血清樣品，按“2.5”項(xiàng)下方法平行制備含藥血清6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄各共有峰保留時(shí)間和面積，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD，結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間均<0.9%，相對(duì)峰面積均<3.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8樣品測(cè)定及分析

取體外供試品溶液以及含藥血清樣品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，通過(guò)分析含藥血清、空白血清、混合對(duì)照品及體外供試品的高效液相色譜圖，確定各入血成分的生藥來(lái)源，并以對(duì)照品色譜峰指認(rèn)各指紋圖譜中的色譜峰成分。

2.9都梁丸血中移行成分分析

都梁丸含藥血清中共含有22種血中移行成分，其4，5，7，9，10，11，12，13，19，21，22，23，24，25，26，27，28，29號(hào)峰為都梁丸中的原形成分入血；14，17，18，20號(hào)峰是體內(nèi)代謝成分和應(yīng)激產(chǎn)物；1，2，3，6，8，15，16號(hào)峰未在都梁丸含藥血清中檢測(cè)出。通過(guò)比對(duì)酒燉白芷給藥后血清和川芎給藥后血清的保留時(shí)間及各峰的紫外吸收，推測(cè)14號(hào)峰為川芎體內(nèi)代謝產(chǎn)物，17，18，20號(hào)峰為酒燉白芷體內(nèi)代謝產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖1，表1。

3討論

實(shí)驗(yàn)中對(duì)小鼠灌胃后眼眶采血時(shí)間進(jìn)行了考察，分別于灌胃后0，2，3，4 h進(jìn)行眼眶取血。結(jié)果灌胃后3 h的血清樣品中，都梁丸血中移行成分較多，峰面積較大，因此，選定3 h為最佳采血時(shí)間。并分別使用甲醇和70%甲醇對(duì)血清樣品的復(fù)溶溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果使用70%甲醇復(fù)溶血清樣品的色譜峰較多，適用于制備含藥血清供試品溶液。

由于都梁丸中化學(xué)成分復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)比較不同的測(cè)定波長(zhǎng)下含藥血清樣品色譜圖基線波動(dòng)情況，分別選取了254，300 nm吸收波長(zhǎng)，300 nm吸收波長(zhǎng)下的色譜圖基線穩(wěn)定，故選擇300 nm吸收波長(zhǎng)。流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇，分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液系統(tǒng)作為流動(dòng)相，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸溶液系統(tǒng)最佳，目標(biāo)化合物分離效果最好。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)都梁丸血清藥物化學(xué)的研究，分析入血原型成分及其代謝成分，可以為篩選都梁丸的質(zhì)量標(biāo)志物提供可行的依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，共有22個(gè)入血成分，其中通過(guò)對(duì)照品鑒別出12個(gè)原型入血成分，其他成分尚需通過(guò)超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜等聯(lián)用技術(shù)進(jìn)一步鑒定。其中水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、歐前胡素、異歐前胡素為君藥酒燉白芷中的香豆素類(lèi)成分，有研究認(rèn)為香豆素類(lèi)成分有鎮(zhèn)痛抗炎的作用，能明顯降低血中和腦中一氧化氮水平，說(shuō)明香豆素類(lèi)成分對(duì)偏頭痛有一定的治療作用。洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、藁本內(nèi)酯為臣藥川芎中苯酚類(lèi)成分，藥理研究發(fā)現(xiàn)苯酚類(lèi)成分有擴(kuò)血管、鎮(zhèn)痛藥理作用，如洋川芎內(nèi)酯Ⅰ可以通過(guò)降低一氧化氮和降鈣素基因相關(guān)肽含量，從而發(fā)揮偏頭痛作用。另外，阿魏酸也來(lái)源于臣藥川芎，具有良好的抗氧化活性。通過(guò)分析原型成分入血吸收強(qiáng)弱(生物利用度)、色譜峰分離度、飲片中含量、穩(wěn)定性及藥理作用，入血原型成分中的水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、歐前胡素、異歐前胡素、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A可作為都梁丸的質(zhì)量標(biāo)志物的重要參考。

后續(xù)研究工作中將基于吸收入血成分作為目標(biāo)，將血清藥物化學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合，更有利于明確吸收入血成分和靶標(biāo)成分的關(guān)系，為都梁丸抗偏頭痛的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。

聲明：本文所用圖片、文字來(lái)源《中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)》2020年2月，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問(wèn)題，請(qǐng)與本網(wǎng)聯(lián)系

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