馬鈴薯粉痂病（Potato powdery scab）是由粉痂菌（Spongospora subterranea f. sp. subterrane）引起的真菌性病害，主要危害根部和塊莖，也可使莖染病。粉痂菌以休眠孢子囊球隨種薯或病殘?bào)w越冬。病薯和土壤中病殘?bào)w為病害的初侵染源，遠(yuǎn)距離傳播主要依靠種薯，田間傳播主要通過(guò)澆水、病土、病肥等。馬鈴薯粉痂病能使馬鈴薯產(chǎn)量減少10%～20%，重者可達(dá)到 50%。

我國(guó)內(nèi)蒙古、廣東、貴州、江西、浙江、云南、吉林、甘肅、福建等地均有馬鈴薯粉痂病的發(fā)生，國(guó)外許多國(guó)家和地區(qū)，如以色列、美國(guó)、巴基斯坦、哥斯達(dá)黎加、韓國(guó)、意大利等均有報(bào)道。由于粉痂菌不能人工培養(yǎng)，國(guó)內(nèi)對(duì)馬鈴薯粉痂菌檢測(cè)的研究較少，其防治藥劑效果也較差，因此，針對(duì)馬鈴薯粉痂菌，亟需建立快速、靈敏、準(zhǔn)確性高的檢測(cè)方法，為該病害的早期監(jiān)測(cè)和預(yù)防提供重
要依據(jù)。

已報(bào)道的土壤帶菌量的檢測(cè)方法有誘餌法、ELISA 法和 PCR 檢測(cè)。Hui 等以番茄幼苗作為誘餌，檢測(cè)到馬鈴薯重茬 0～10 cm 土壤中的馬鈴薯粉痂病菌。但是番茄幼苗誘餌法只能檢測(cè)到土壤中粉痂病菌活的游動(dòng)孢子，無(wú)法檢測(cè)到休眠孢子且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、操作繁瑣。Liu 等利用棉花黃萎病的病原菌菌絲蛋白作為抗原，制備該病原菌菌絲蛋白的多克隆抗體，建立特異性檢測(cè)棉花黃萎病菌的間接 ELISA 方法，但由于真菌結(jié)構(gòu)與物質(zhì)組成復(fù)雜,尋找特異性抗原有很大難度；近年來(lái)，由于 PCR 技術(shù)更加快速、準(zhǔn)確、便捷而被廣泛應(yīng)用于病原菌的檢測(cè)和定量研究。Guo 等[21]通過(guò)篩選不同瘡痂菌的通用探針，建立了馬鈴薯瘡痂菌的快速 PCR 檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)病組織和土壤樣品的快速檢測(cè)；Nian 等通過(guò)建立實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 體系從而快速準(zhǔn)確鑒定了小麥黑穗菌（Tilletia controversa Kühn），應(yīng)用于小麥矮腥黑穗病的早期診斷。

Graff 等根據(jù)馬鈴薯粉痂菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)大小為 61 bp 的特異性引物 SsTQF1/SsTQR1 和一個(gè)熒光 Taqman®探針 SsTQP1，可以檢測(cè)和定量懸浮在水中或與粘土混合的休眠孢子堆。Qu 等[24]根據(jù)馬鈴薯粉痂菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄設(shè)計(jì)了大小為 434 bp SSF/SSR 引物，該研究成功地應(yīng)用于有無(wú)粉痂病癥狀的帶菌馬鈴薯塊莖的檢測(cè)，可以檢測(cè)到1/g土的孢子球。鑒于目前缺乏對(duì)馬鈴薯粉痂菌快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，本研究基于馬鈴薯粉痂菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和線(xiàn)粒體 DNA，分別設(shè)計(jì)了適用于初步檢測(cè)的普通PCR 特異性引物和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 特異性引物，建立了快速、高靈敏性的檢測(cè)體系。針對(duì)在生產(chǎn)中馬鈴薯粉痂病危害嚴(yán)重，缺乏病原菌快速檢測(cè)的方法的情況。本研究通過(guò)篩選特異性好、穩(wěn)定性高的粉痂菌特異性引物，建立馬鈴薯粉痂病快速檢測(cè)體系，以期為馬鈴薯粉痂病的早期預(yù)警提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

試驗(yàn)所用的粉痂菌（S. subterranea）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、葫蘆科刺盤(pán)孢菌（Colletotrichum lagenarium）、尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）、核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum）、茄匍柄霉菌（Stemphylium solani）、疫霉菌（Phytophthora infestans）、多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）、細(xì)極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、瘡痂鏈霉菌（Streptomyces scabies）均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所分離保存（表 1）。

1.2 DNA 提取

馬鈴薯粉痂病斑或培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)一周的菌絲體，采用植物基因組 DNA 提取試劑盒提取植物基因組或病原菌基因組 DNA。混有休眠孢子囊的菌土和田間土壤總 DNA 提取采用 TIANamp Soil DNA Kit 土壤基因組 DNA 提取試劑盒提取土壤總 DNA。NanoDrop 2000定量 DNA 濃度，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù) NCBI GenBank 中已登記的馬鈴薯粉痂菌及其他非靶標(biāo)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株基因序列（表2），利用DNAMAN 8.0 軟件比對(duì)，選取粉痂菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和線(xiàn)粒體 DNA 的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)了兩對(duì)應(yīng)用于普通 PCR 的特異性引物 A5: 5'-ACAACTCTTAACAGTGG-3'，A9: 5'-AATGGTTAGAGACGAATC-3'，C3: 5'-AATCTAGAGCACCCCGTTTTCATTCG-3'，C8: 5'-TGCGCAAACCTTAATACGGGAA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為 281 和 391bp；和一對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的特異性引物 QF: 5'-GCAACTAAATAAAATTTAATGCTAAAAGTG-3'，QR:5'-TTTGTACGCTAAGTTCGATAGGAG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 104 bp（圖 1）。引物均由北京博邁德基因公司合成。

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