4中藥血清譜效學(xué)研究瓶頸

中藥血清譜效學(xué)研究環(huán)節(jié)中存在諸多研究瓶頸，如實驗動物狀態(tài)的選擇、血樣處理方案的優(yōu)化、中藥血清多維譜效學(xué)的構(gòu)建、合適數(shù)據(jù)處理方法的選擇等問題對中藥血清譜效學(xué)研究結(jié)果存在較大的影響，因此筆者就上述問題進行剖析，以期為后期中藥血清譜效學(xué)深入研究提供參考。

4.1實驗動物狀態(tài)的選擇

中藥血清藥理學(xué)的精髓在于巧妙地利用了生物體對中藥復(fù)雜成分的選擇和濾過作用，使復(fù)雜研究得以簡化，因此，選擇不同生理狀態(tài)的實驗動物對中藥入血成分研究至關(guān)重要。盡管目前相關(guān)文獻報道中多采用正常動物給藥血清，但是有文獻報道發(fā)現(xiàn)病理與正常狀態(tài)下動物中藥入血成分不一，如姚紅銳等對比了正常狀態(tài)和高脂血癥模型狀態(tài)下大鼠的含藥血清，發(fā)現(xiàn)毛菊苣有效部位在正常大鼠中有6個入血成分，但在高脂血癥模型大鼠中僅檢測到1個微量成分。王元清等研究高脂血癥和正常大鼠給予淫藤骨痹康方總萜后體內(nèi)代謝指紋圖譜的差異，發(fā)現(xiàn)不同生理狀態(tài)下大多數(shù)共有峰的峰面積存在顯著性差異。由此可見，機體在病理狀態(tài)下對中藥的吸收、轉(zhuǎn)化速率與正常生理狀態(tài)下不同，因此，為使動物含藥血清更精確地表征臨床病理狀態(tài)下的入血成分，應(yīng)采用病理模型狀態(tài)下的動物血清進行藥物化學(xué)研究。

4.2優(yōu)化血樣處理方案

合適的血樣處理方法是中藥血清譜效學(xué)研究的基石，因此優(yōu)化血樣處理方法，盡可能多地保留血樣中的化學(xué)成分已成為中藥血清譜效學(xué)研究的核心問題之一。由于動物血清中含有多種內(nèi)源性蛋白，嚴(yán)重干擾血中移行成分的檢測分析，故應(yīng)考慮首先除去血清中的蛋白質(zhì)。目前常用蛋白處理方法有溶劑法、超濾法、加熱法、柱色譜法等，其中去除蛋白質(zhì)以溶劑法為主，分離純化以萃取法為主。血清蛋白的處理方法各有特點：溶劑法主要包括有機溶劑沉淀、強酸溶液沉淀、液-液萃取等，具有操作簡單、去除蛋白率高且較適合大樣本處理的特點；柱色譜法具有分離效果好、回收率高、重現(xiàn)性良好，可避免乳化現(xiàn)象等優(yōu)勢，缺點是不適合大樣本處理；超濾法操作簡單，不需要改變樣品的理化性質(zhì)，適用于待測組分含量低、熱穩(wěn)定性差的情況，但可能引起部分成分滯留于膜上，從而造成某些成分含量減少；加熱法操作簡單，但不適合于熱穩(wěn)定差的化學(xué)成分。此外，在處理含藥血清過程中，由于某些成分可能與纖維蛋白或血細(xì)胞吸附或結(jié)合，從而引起部分中藥成分損失，因此，為較全面地研究血樣中的化學(xué)成分，有學(xué)者提出可將血清和血漿藥物化學(xué)二者結(jié)合進行相應(yīng)研究。

4.3構(gòu)建中藥血清多維譜效學(xué)

中藥血清藥物化學(xué)認(rèn)為中藥有效物質(zhì)必須以血液為介質(zhì)輸送到靶點，從而發(fā)揮藥效作用，而且中藥成分復(fù)雜，各種性質(zhì)均有差別，各成分吸收部位或吸收速率也各不相同，且進入體內(nèi)的方式也各不相同，致使單個化學(xué)指紋圖譜難以全面表征中藥入血成分。因此，為了準(zhǔn)確得到中藥化學(xué)成分在體內(nèi)的動態(tài)變化及與藥物原型成分的相互關(guān)聯(lián)作用，建立能夠較全面反映中藥入血的血清藥物化學(xué)動態(tài)圖譜就變得尤為重要。基于此，業(yè)內(nèi)學(xué)者在此基礎(chǔ)上提出了中藥多維譜效學(xué)，即使用不同儀器分析方法（檢測器）來獲取樣品化學(xué)信息，通過綜合多種儀器分析方法，建立信源不同、信息互補的多維指紋圖譜，以便完整地表征中藥復(fù)雜物質(zhì)體系的整體化學(xué)特征。與此同時，由于中藥是一個集化學(xué)成分和生物效應(yīng)多樣性的復(fù)雜體，因此，采用單一的藥效指標(biāo)難以全面反映中藥的藥效信息，孫莉瓊等建議開展中藥多維譜效學(xué)時選擇多種活性指標(biāo)，即從整體水平、組織器官和細(xì)胞分子水平等不同層次開展中藥藥效學(xué)研究，建立中藥體內(nèi)外多維藥效信息。雖然多維譜效學(xué)尚未在中藥血清譜效學(xué)中廣泛開展，但隨著中藥血清譜效學(xué)的深入研究，相信該方法在揭示中藥物質(zhì)基礎(chǔ)領(lǐng)域?qū)l(fā)揮出獨特的優(yōu)勢。

4.4選擇合適的數(shù)據(jù)處理方法

中藥血清譜效學(xué)研究中，譜與效需要通過數(shù)據(jù)提取與有機結(jié)合才能進一步揭示中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，譜效關(guān)系數(shù)據(jù)處理方法不一，常用的數(shù)據(jù)處理方法優(yōu)勢與不足如下：（1）直觀比較法：優(yōu)勢是簡便易行，但是具有一定的主觀性；（2）相關(guān)分析：能夠給出峰與藥效指標(biāo)間的密切程度，包括相關(guān)性大小、顯著程度及變化方向，但不能解釋各個特征峰與藥效的協(xié)同作用；（3）典型相關(guān)分析：其特點是可通過研究相關(guān)關(guān)系較大的幾對典型變量，就可替代原來兩組變量之間的相關(guān)關(guān)系研究；（4）灰色關(guān)聯(lián)度分析：對數(shù)據(jù)的要求降低，原理簡單，能夠給出峰與藥效的關(guān)聯(lián)度大小，間接給出各峰對藥效的貢獻度，但無法給出各峰對藥效的綜合貢獻度；（5）聚類分析：考察同類樣品的共性特征和異類樣品的差異特征，從整體的角度分析并比較不同指標(biāo)的相似性及分類情況，排除相關(guān)性較差變量的影響，但無法體現(xiàn)各峰與藥效的相關(guān)性大小和方向；（6）主成分分析：簡化數(shù)據(jù)，能夠?qū)?shù)據(jù)降維，缺點是提取的主成分?jǐn)?shù)量小于原始變量數(shù)且不能給出2組分析變量的相關(guān)性大小和數(shù)學(xué)模型；（7）多元線性回歸分析：主要是偏最小二乘回歸分析，該方法在譜效關(guān)系數(shù)據(jù)處理中使用最為廣泛，集多元線性回歸、典型相關(guān)分析及主成分分析的基本功能為一體，消除自變量選取時可能存在的多重共線性問題，可以最大限度地利用數(shù)據(jù)信息，預(yù)測精確度高，結(jié)果易于解釋，因此，建議采用偏最小二乘回歸分析來進行中藥血清“譜”與“效”的數(shù)據(jù)分析。

4.5其他問題

除上述瓶頸外，在開展中藥血清譜效學(xué)研究時還需注意其他問題，如采血時間的選擇和血清的處理方法等。采血時間應(yīng)選擇在服用藥物后血藥濃度達(dá)到最高值時，這樣能夠避免藥物中的有效物質(zhì)因代謝而減少，從而造成假陰性的結(jié)果。但是由于中藥所含成分復(fù)雜、多樣，給藥后達(dá)峰值時間不同，因此給采血時間的選擇帶來了很大的難度。通過梳理相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，目前常用的給藥次數(shù)和采血時間包括：（1）每日2次，連續(xù)給藥3 d；（2）每日1次，連續(xù)給藥7 d；（3）每日2次，連續(xù)給藥5 d等采血方案。然而中藥化學(xué)成分復(fù)雜，不同藥物血藥濃度達(dá)峰的時間不同，給采血時間的選取帶來一定困難，因此筆者建議可結(jié)合藥動學(xué)進行參數(shù)分析，通過藥物入血指紋圖譜和藥動模型數(shù)據(jù)優(yōu)化最佳采血時間。此外，目前體外藥效學(xué)研究中含藥血清的制備方法廣泛采用56℃水浴加熱，30 min滅活，微孔濾膜濾過，該方法較好地對血清中的酶、抗體、補體、細(xì)胞因子及其他生理活性物質(zhì)進行滅活，減少可能會對體外培養(yǎng)的細(xì)胞、病毒、組織器官產(chǎn)生的影響，提高藥效評價的準(zhǔn)確度。然而有學(xué)者提出，血清一旦滅活血，由藥物激發(fā)的血清中內(nèi)生性成分（如補體、酶）將減少或喪失，進而影響藥理作用。因此開展中藥血清藥物化學(xué)-藥理學(xué)譜效關(guān)系時，筆者建議可設(shè)立正常血清空白組來排除血清內(nèi)生性成分對實驗結(jié)果的影響，從而獲得全面反映中藥真實的藥效數(shù)據(jù)。

5結(jié)語與展望

中藥血清譜效學(xué)是通過體內(nèi)血清化學(xué)指紋圖譜及相應(yīng)的藥效，通過數(shù)據(jù)處理方法，對機體與中藥之間的相互作用進行探索，同時對中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)進行快速的篩選，較好地體現(xiàn)了中醫(yī)藥整體觀念的特點。然而，中藥血清譜效學(xué)是建立在“只有入血成分才可能是藥效成分”的假說基礎(chǔ)之上，該理論也存在一些局限性，如外用中藥或含多糖類中藥不適合該理論。此外，如何采用現(xiàn)代語言來表征中醫(yī)證侯學(xué)并將其應(yīng)用于中藥血清譜效學(xué)研究中，將傳統(tǒng)中醫(yī)藥與現(xiàn)代西方醫(yī)學(xué)進行對接，是推動中醫(yī)藥走向現(xiàn)代化和國際化的關(guān)鍵問題?；诖耍跸曹娊淌谔岢隽酥嗅t(yī)方證代謝組學(xué)，是以代謝組學(xué)技術(shù)建立方劑有效性評價體系，揭示證候生物學(xué)本質(zhì)，以中藥血清藥物化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)方劑體內(nèi)直接作用物質(zhì)，通過建立兩者之間的相關(guān)性來表征與證候生物學(xué)本質(zhì)相關(guān)的藥效物質(zhì)。筆者認(rèn)為將中醫(yī)方證代謝組學(xué)與中血清譜效學(xué)進行有機的整合，將進一步深化對傳統(tǒng)中醫(yī)辨證論治和整體觀念的理解和發(fā)展，為中醫(yī)藥的國際化和現(xiàn)代化起到推波助瀾的作用。

聲明：本文所用圖片、文字來源《中草藥》2020年7月，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請與本網(wǎng)聯(lián)系

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